Genome-scale Activation Screen Identifies a LncRNA Locus that Regulates a Gene Neighborhood

基因組規(guī)模激活篩選識(shí)別調(diào)節(jié)基因鄰域的LncRNA基因座

期刊：Nature；影響因子：41.577

發(fā)表單位：麻省理工學(xué)院

    使用基因組規(guī)模篩選的方式可以系統(tǒng)地識(shí)別影響特定細(xì)胞過(guò)程的許多l(xiāng)ncRNA基因座，并促進(jìn)表征這些基因座的生物學(xué)功能。

    我們利用基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9激活篩選發(fā)現(xiàn)了11個(gè)新的lncRNA基因座，在募集活化劑后，每個(gè)基因座介導(dǎo)BRAF抑制劑對(duì)黑色素瘤的抗性。對(duì)一種候選物（稱為EMICERI）的詳細(xì)分析顯示，其轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致四種相鄰蛋白質(zhì)編碼基因的劑量依賴性激活，其中一種賦予抗性表型。

    哺乳動(dòng)物基因組包含數(shù)千個(gè)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）的基因座，其中一些已知在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。LncRNA基因座可通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞調(diào)節(jié)：雖然有些編碼非局部（反式）作用的RNA，但新出現(xiàn)的證據(jù)表明許多l(xiāng)ncRNA基因座在局部（順式）起作用，例如，通過(guò)lncRNA啟動(dòng)子的功能，lncRNA轉(zhuǎn)錄的過(guò)程，或lncRNA轉(zhuǎn)錄本身在調(diào)節(jié)附近基因的表達(dá)。盡管它們具有潛在的重要作用，但鑒定功能性lncRNA基因座并區(qū)分這些和其他機(jī)制仍然具有挑戰(zhàn)性。

    我們以前使用Cas9協(xié)同激活介質(zhì)（SAM）來(lái)篩選蛋白質(zhì)編碼基因，這些基因賦予黑素瘤細(xì)胞對(duì)BRAF抑制劑維羅非尼的抗性，使其成為高通量篩選功能性lncRNA基因座的理想表型。我們?cè)O(shè)計(jì)了基因組規(guī)模的sgRNA文庫(kù)，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)A375（BRAF（V600E））黑色素瘤細(xì)胞，在2μM 維羅非尼或?qū)φ眨ǘ谆鶃嗧浚?/span>DMSO）中培養(yǎng)，并在藥物處理14天后測(cè)序sgRNA的分布。RIGER分析鑒定了16個(gè)顯著富集的候選基因座，先前都未在功能上表征。我們?cè)诩せ罹哂袕?qiáng)效應(yīng)的11個(gè)基因座中的每一個(gè)時(shí)進(jìn)行RNA測(cè)序，并且發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)的全局變化與維羅非尼抗性一致，支持這些基因座與篩選表型的功能相關(guān)性。

    接下來(lái)，我們分析這些基因座的激活可能導(dǎo)致抗性的機(jī)制，其可包括lncRNA轉(zhuǎn)錄物的非局部功能；lncRNA轉(zhuǎn)錄物的局部功能或其轉(zhuǎn)錄；lncRNA基因座中DNA元件的局部功能；SAM的局部功能四種方式。為了集中于機(jī)制可能需要lncRNA或其轉(zhuǎn)錄的基因座，我們激活了每個(gè)基因座并檢測(cè)到這11個(gè)基因座中的6個(gè)的穩(wěn)健的lncRNA轉(zhuǎn)錄物上調(diào)。剩余的5個(gè)基因座可以通過(guò)除了激活lncRNA轉(zhuǎn)錄物之外的機(jī)制起作用。

    我們通過(guò)隨機(jī)慢病毒整合過(guò)表達(dá)編碼每個(gè)lncRNA的cDNA，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何影響耐藥性，表明這些位點(diǎn)可能不通過(guò)非本地功能起作用。在6個(gè)基因座中的5個(gè)，我們發(fā)現(xiàn)SAM靶向?qū)е?/span>1到8個(gè)附近蛋白質(zhì)編碼基因的差異表達(dá)。例如，NR_109890的激活上調(diào)其鄰近基因EBF1，并且TCONS_00015940的激活導(dǎo)致4種相鄰蛋白質(zhì)編碼基因的劑量依賴性上調(diào)?？傊?，這些分析表明，沒(méi)有一個(gè)lncRNA基因座似乎通過(guò)產(chǎn)生反式作用RNA來(lái)賦予維羅非尼抗性；相反，基因座可以調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)附近基因的表達(dá)。

    我們發(fā)現(xiàn)TCONS_00015940實(shí)際上由兩個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄本組成。我們將這些轉(zhuǎn)錄物命名為“EQTN MOB3B IFNK C9orf72增強(qiáng)子RNA I”，或EMICERI和EMICERII。為了確定EMICERI基因鄰域的協(xié)調(diào)上調(diào)如何導(dǎo)致維羅非尼抗性，我們過(guò)表達(dá)了4種蛋白質(zhì)編碼基因中的每一種的cDNA以及來(lái)自隨機(jī)整合的慢病毒的EMICERI或II lncRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有MOB3B過(guò)表達(dá)導(dǎo)致維羅非尼抗性。我們發(fā)現(xiàn)MOB3B過(guò)表達(dá)下調(diào)LATS1以激活Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路。我們將我們的觀察擴(kuò)展到我們當(dāng)初篩查的細(xì)胞系之外，通過(guò)顯示EMICERI和MOB3B的激活在另外兩個(gè)敏感的黑素瘤細(xì)胞系中賦予了維羅非尼耐藥，并與來(lái)自癌癥基因組圖譜的黑素瘤患者維羅非尼耐藥的基因表達(dá)特征相關(guān)?？傊?/span>，這些結(jié)果表明EMICERI基因座的激活通過(guò)MOB3B的上調(diào)和隨后的Hippo信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活賦予了維羅非尼抗性。

    將SAM靶向共享的EMICERI/MOB3B啟動(dòng)子可能僅通過(guò)直接激活MOB3B來(lái)賦予抗性。我們使用CRISPR-dCas9、反義寡核苷酸（ASO）轉(zhuǎn)染、攜帶3個(gè)串聯(lián)多腺苷酸化信號(hào)（pAS）插入的克隆A375細(xì)胞系三種擾動(dòng)方法來(lái)干擾EMICERI轉(zhuǎn)錄并觀察對(duì)MOB3B的影響，結(jié)果表明EMICERI的轉(zhuǎn)錄是完全激活MOB3B所必需的，證實(shí)EMICERI是一種功能性非編碼基因座，其激活四個(gè)相鄰的蛋白質(zhì)編碼基因并有助于篩選表型。接下來(lái)我們確定EMICERI轉(zhuǎn)錄本身的功能還是其轉(zhuǎn)錄過(guò)程才是MOB3B活化所必需的。我們發(fā)現(xiàn)靶向MOB3B TSS下游的dCas9成功阻斷了MOB3B轉(zhuǎn)錄并降低了EMICERI和其他相鄰基因的表達(dá)；類似地，在SAM激活的背景下，靶向MOB3B內(nèi)含子的ASO減少了MOB3B和EMICERI的激活?？傊?/span>EMICERI和MOB3B擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)表明，lncRNA（EMICERI）和mRNA（MOB3B）的轉(zhuǎn)錄在正反饋機(jī)制中相互調(diào)節(jié)，然后可能通過(guò)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的一般過(guò)程激活更廣泛的基因鄰域。

    理解基因組調(diào)控邏輯的主要挑戰(zhàn)是鑒定功能性lncRNA基因座并表征其機(jī)制。在這里，我們證明基因組規(guī)模的激活篩選能夠系統(tǒng)地識(shí)別影響特定細(xì)胞過(guò)程的許多l(xiāng)ncRNA基因座，促進(jìn)了解這些關(guān)鍵基因座的功能和機(jī)制的努力。這種非編碼功能獲取篩查方法在其他環(huán)境中的進(jìn)一步應(yīng)用，以及功能喪失篩查方法和我們的表征策略，將有助于闡明這些知之甚少的參與者在發(fā)育和疾病中的復(fù)雜作用。

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