PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identi?es oncogenic drivers and biomarkers

S期富集的lncRNA的泛癌分析鑒定致癌驅(qū)動(dòng)因子和生物標(biāo)志物

期刊：Nature Communications；影響因子：12.353 

發(fā)表單位：哥德堡大學(xué) 

    該研究采用新生RNA測(cè)序的研究結(jié)合數(shù)據(jù)聚類分析、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)與嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床數(shù)據(jù)調(diào)查，將腫瘤相關(guān)lncRNAs篩選出來(lái)，最后提供了一個(gè)基于S期相關(guān)的lncRNA中具有潛在預(yù)后價(jià)值的致癌因子或腫瘤標(biāo)志物的綜合性列表。

    本研究提供了基于lncRNA的致癌驅(qū)動(dòng)因子的綜合列表，具有潛在的預(yù)后價(jià)值。在這里，使用新生RNA捕獲測(cè)序，我們識(shí)別1145個(gè)時(shí)間表達(dá)的S期富集的lncRNA。其中，570個(gè)lncRNA在TCGA數(shù)據(jù)集中的至少一種腫瘤類型中顯示出顯著的差異表達(dá)。14個(gè)Pan-Cancer數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)臨床研究確定了633個(gè)獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物。在幾種癌癥模型中沉默頂部差異表達(dá)和臨床相關(guān)的S期富集的lncRNA影響關(guān)鍵的癌細(xì)胞標(biāo)志。SCAT7在多種癌癥類型中的機(jī)制研究表明，它與hnRNPK/YBX1復(fù)合物相互作用，并通過(guò)調(diào)節(jié)FGF/FGFR及其下游PI3K/AKT和MAPK通路影響癌細(xì)胞標(biāo)志。

    盡管研究lncRNA在癌癥中的作用的研究數(shù)量增加，但我們對(duì)癌癥發(fā)生和發(fā)展中lncRNA的理解以及它們與臨床預(yù)后的相關(guān)性尚處于起步階段。在這項(xiàng)研究中，我們提出了兩個(gè)基本命題，可以增強(qiáng)當(dāng)前對(duì)lncRNA在癌癥發(fā)展和進(jìn)展中的關(guān)鍵作用的理解。首先，我們研究S期特異性lncRNA對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)展和其他重要癌癥相關(guān)標(biāo)志的貢獻(xiàn)。其次，我們研究了S期特異性lncRNA在不同癌癥中作為獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物的能力。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，我們?cè)?/span>S期進(jìn)展期間采用新生的RNA-seq并產(chǎn)生基于lncRNA的致癌癌驅(qū)動(dòng)因子的資源，其可用作風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的預(yù)后標(biāo)志物以及癌癥治療中的潛在治療方案。

    使用胸苷和羥基脲使HeLa細(xì)胞在G1/S邊界同步，隨后，釋放G1/S阻斷并使細(xì)胞在5-乙炔基尿苷（EtU）存在下進(jìn)行，以便在不同的S期時(shí)間點(diǎn)特異性地標(biāo)記新合成的新生RNA群。我們分別在EtU標(biāo)記和未標(biāo)記樣品中獲得1145個(gè)具有四種顯著時(shí)間表達(dá)模式的lncRNA和具有兩種顯著時(shí)間模式的937個(gè)lncRNA。我們隨機(jī)選擇動(dòng)態(tài)表達(dá)的S期lncRNA，并在EtU標(biāo)記和未標(biāo)記樣品中跨不同細(xì)胞周期階段（G1，S和G2/M）驗(yàn)證它們的時(shí)間表達(dá)模式。

我們利用來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）的6419種實(shí)體瘤和701種正常組織樣品的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，這些樣品來(lái)自16種癌癥類型。分析顯示，1145個(gè)S期特異性lncRNA中的570個(gè)在至少一種癌癥類型中差異表達(dá)，對(duì)數(shù)倍變化±2和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<1E-004。有趣的是，近73％的差異表達(dá)的lncRNA在相應(yīng)的癌癥類型中顯示出上調(diào)。這些觀察結(jié)果表明，這些lncRNAs在多種癌癥中表現(xiàn)出差異表達(dá)，并且可以作為理解它們?cè)诎┌Y發(fā)展和進(jìn)展中的作用的潛在候選者。

    對(duì)570個(gè)差異表達(dá)的S期lncRNA啟動(dòng)子進(jìn)行CpG甲基化分析，發(fā)現(xiàn)35個(gè)lncRNA表現(xiàn)出差異甲基化。我們分析了S期lncRNAs的基因-體甲基化，并發(fā)現(xiàn)20個(gè)與基因表達(dá)相關(guān)的基因體差異甲基化的轉(zhuǎn)錄本。在20個(gè)lncRNA中，7個(gè)是高甲基化和高度表達(dá)的，而13個(gè)lncRNA是低甲基化的，在腫瘤中表達(dá)較低。對(duì)于每種癌癥類型，我們根據(jù)每種lncRNA的表達(dá)水平將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。然后，我們使用Kaplan-Meier（KM）方法評(píng)估存活率的差異。我們基于二分法的系統(tǒng)分析鑒定了520個(gè)S期lncRNA，其預(yù)測(cè)存活并且還至少在一種癌癥類型中充當(dāng)潛在的獨(dú)立生物標(biāo)志物。多變量模型證明KIRC具有最大數(shù)量的基于S期cncRNA的預(yù)后生物標(biāo)志物。值得注意的是，RP11-59D5__B.2是我們臨床研究的首選候選者，它作為五種癌癥的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)：BLCA，KIRC，KIRP，STAD和HNSC?？傊?/span>大部分S期lncRNA在不同癌癥類型中顯示出與臨床協(xié)變量相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后能力。

    為了進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，我們?cè)?/span>TCGA數(shù)據(jù)集中具有較高頻率差異表達(dá)的頂級(jí)候選者中選擇了8個(gè)S期lncRNA，其也獨(dú)立地預(yù)測(cè)患者在多種癌癥中的存活。此后，我們將所選候選者稱為S期癌癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄物（SCAT）。我們使用HeLa細(xì)胞作為模型系統(tǒng)使用小干擾RNA寡核苷酸（siRNA）或鎖定核酸（LNA）反義寡核苷酸耗盡SCAT。我們使用比色MTT測(cè)定評(píng)估發(fā)現(xiàn)SCAT耗盡誘導(dǎo)顯著影響細(xì)胞增殖。使用流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估發(fā)現(xiàn)SCAT的功能喪失誘導(dǎo)細(xì)胞周期擾動(dòng)，伴隨G1期細(xì)胞的積累和DNA合成的減少。此外，SCAT的下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如胱天蛋白酶3/7活性的顯著增加所示。

    我們的臨床研究顯示CTD-2357A8.3（SCAT1）和LUCAT1（SCAT5）分別作為肺和腎源性癌癥的常見獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。LUAD和LUSC中SCAT1的較高表達(dá)與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。另外，SCAT1顯示同步A549細(xì)胞的S期中表達(dá)升高。與臨床數(shù)據(jù)一致，A549細(xì)胞中SCAT1的下調(diào)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的顯著抑制，G1期細(xì)胞周期停滯，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，表明其在肺癌發(fā)生中的作用。類似地，在五種癌癥中差異表達(dá)的SCAT5在所有三種類型的腎癌（KIRP，KIRC和KICH）中充當(dāng)獨(dú)立的預(yù)后因子。其較高的表達(dá)預(yù)測(cè)所有三種癌癥中的不良臨床結(jié)果并且與其他SCAT相似，在Caki-2細(xì)胞的S期期間誘導(dǎo)SCAT5表達(dá)。 Caki-2細(xì)胞中SCAT5的消耗導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少，G1期細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

    使用siRNA或短發(fā)夾RNA下調(diào)SCAT7的表達(dá)，Northern印跡分析中敲低細(xì)胞中SCAT7變體的下調(diào)表明我們的RNAi敲低實(shí)驗(yàn)的特異性。Caki-2,786-O，A549，H2228，HepG2和MCF7細(xì)胞中SCAT7的下調(diào)影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展，細(xì)胞在G1期優(yōu)先積累。另外，即使在非癌性HEK293細(xì)胞中，SCAT7的敲低也導(dǎo)致增殖減少。此外，SCAT7消除改變了多個(gè)細(xì)胞系中的S期進(jìn)展，值得注意的是，與其他細(xì)胞系相比，H2228細(xì)胞中SCAT7的瞬時(shí)敲低誘導(dǎo)了G2/M期細(xì)胞的顯著積累。我們接下來(lái)關(guān)注Caki-2,786-O和A549穩(wěn)定KD細(xì)胞系，以闡明SCAT7在細(xì)胞凋亡，細(xì)胞活力，細(xì)胞遷移和侵襲中的功能作用。觀察發(fā)現(xiàn)SCAT7的過(guò)表達(dá)分別在Caki-2和A549細(xì)胞中使細(xì)胞增殖增加2.08倍和1.9倍。然而，由于其對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的遺傳抗性，我們無(wú)法在786-O細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)SCAT7?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的數(shù)據(jù)證明了SCAT7在調(diào)節(jié)多種癌細(xì)胞系中一些最重要的癌癥標(biāo)志中的關(guān)鍵作用。

    我們使用了兩種成纖維細(xì)胞系：BJ和TIG3，用B-RAF轉(zhuǎn)化永生化，使用三種siRNA瞬時(shí)下調(diào)SCAT7 72小時(shí)誘導(dǎo)兩種細(xì)胞系的衰老。然后我們尋求在誘導(dǎo)早衰時(shí)評(píng)估SCAT7的轉(zhuǎn)錄活性。為此，我們用200nM的4-HT處理BJ-BRAF細(xì)胞72小時(shí)，并檢查一些衰老相關(guān)標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄激活。有趣的是，過(guò)早衰老的開始導(dǎo)致SCAT7表達(dá)的顯著降低。另一方面，SCJ7在BJ-BRAF成纖維細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)增加了它們的增殖以及關(guān)鍵衰老標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄活性。過(guò)表達(dá)SCAT7的細(xì)胞能夠繞過(guò)他莫昔芬誘導(dǎo)的衰老。我們接下來(lái)在SCAT7下調(diào)后對(duì)HeLa，A549和Caki-2細(xì)胞系進(jìn)行β-半乳糖苷酶染色。SCAT7的下調(diào)誘導(dǎo)HeLa和A549細(xì)胞的衰老表型，而Caki-2細(xì)胞保持不受影響。因此，我們的數(shù)據(jù)證明了SCAT7在調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老中的關(guān)鍵作用，突出了細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期進(jìn)展和衰老之間的串?dāng)_。

    RNA-seq數(shù)據(jù)的后續(xù)功能富集分析顯示，SCAT7的消耗影響了主要的信號(hào)傳導(dǎo)通路和重要的生物過(guò)程。例如，FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK通路受到很大影響，同時(shí)細(xì)胞增殖，細(xì)胞粘附，細(xì)胞衰老，細(xì)胞遷移和凋亡過(guò)程也受到干擾?；?/span>RNA-seq分析和隨后跨不同細(xì)胞系的驗(yàn)證，我們假設(shè)SCAT7通過(guò)調(diào)節(jié)不同的FGF/FGFR成員來(lái)調(diào)節(jié)一些癌癥標(biāo)志。使用兩種siRNA分別在HeLa和Caki-2細(xì)胞中耗盡FGFR2，并且使用A549細(xì)胞中的esiRNA分別耗盡FGFR3和FGFR4。有趣的是，FGFR2消耗對(duì)細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和活力的影響表現(xiàn)出SCL7消耗在HeLa和Caki-2細(xì)胞中的作用。此外，當(dāng)FGFR2沉默時(shí)，SCAT7誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖減弱；表明SCAT7誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖部分地通過(guò)FGF/FGFR2信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)行?？傊?，我們的數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明SCAT7通過(guò)調(diào)節(jié)FGF/FGFR和下游PI3K/AKT和Ras/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞周期進(jìn)程。

    我們首先確定了SCAT7的亞細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)它在核質(zhì)和染色質(zhì)區(qū)室中富集。然后，我們使用生物素化的寡核苷酸在UV交聯(lián)細(xì)胞中進(jìn)行染色質(zhì)寡聚親和沉淀（ChOP）以下拉SCAT7及其相互作用的蛋白質(zhì)。我們使用RNA免疫沉淀（RIP）測(cè)定和ChOP下拉然后Western印跡驗(yàn)證了hnRNPK和YBX1蛋白與SCAT7的相互作用。我們通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)評(píng)估了hnRNPK和YBX1在FGFR2啟動(dòng)子上的特異性結(jié)合，并且這種結(jié)合在SCAT7下調(diào)后顯著降低。類似地，hnRNPK和YBX1占據(jù)了FGFR3的啟動(dòng)子區(qū)域，并且它們的結(jié)合在SCAT7下調(diào)后特異性地受到影響。此外，我們觀察到SCAT7耗盡細(xì)胞中FGFR編碼區(qū)的RNA聚合酶II占據(jù)率降低?？傊?，這些觀察結(jié)果表明SCAT7/hnRNPK/YBX1 RNP在不同癌癥模型中的FGFR2和/或FGFR3的轉(zhuǎn)錄激活中起關(guān)鍵作用。

    我們將A549細(xì)胞皮下移植到裸鼠體內(nèi)。植入后6周，我們應(yīng)用基于皮下注射兩種獨(dú)立的靶向SCAT7的LNA反義寡核苷酸的治療方案，每周兩次。我們?cè)趦纱为?dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行四次注射后測(cè)量腫瘤體積，并且與加擾的LNA對(duì)照組相比，在SCAT7 LNA組中觀察到40-50％腫瘤生長(zhǎng)抑制（TGI）。此外，異種移植物中SCAT7的表達(dá)水平與腫瘤體積相關(guān)，并且僅在具有有效SCAT7下調(diào)的腫瘤中觀察到腫瘤生長(zhǎng)減少。此外，我們對(duì)攜帶KRAS的致癌突變形式的肺轉(zhuǎn)移性患者來(lái)源的異種移植物（PDX）小鼠模型在15天內(nèi)實(shí)施SCAT7 LNA依賴性治療干預(yù)。注射SCAT7 LNA的PDX小鼠模型顯示出生長(zhǎng)速率以及移植腫瘤的體積（約46％）的顯著降低。這些結(jié)果共同表明SCAT7是致癌的lncRNA，并且它可以用作治療不同癌癥的可能的治療靶標(biāo)。

    總的來(lái)說(shuō)，我們提供了基于lncRNA的致癌驅(qū)動(dòng)因子的綜合列表，具有潛在的預(yù)后價(jià)值。更重要的是，這系統(tǒng)地分析了功能性和臨床相關(guān)的lncRNA可以作為描述lncRNA與腫瘤發(fā)展和進(jìn)展之間的功能聯(lián)系的資源。

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