PRMT5 circular RNA promotes metastasis of urothelial carcinoma of the bladder through sponging miR-30c to induce epithelial-mesenchymal transition 

PRMT5 circRNA通過(guò)海綿狀miR-30c促進(jìn)膀胱尿路上皮癌的轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

期刊：Clin. Cancer Res.；影響因子：10.199

發(fā)表單位：華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

    CircPRMT5在促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT和/或侵襲性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且是該疾病的預(yù)后生物標(biāo)志物，表明circPRMT5可以作為UCB患者的可利用治療靶標(biāo)

    在本研究中，我們旨在鑒定調(diào)節(jié)膀胱尿路上皮癌（UCB）細(xì)胞EMT的新型circRNA，并探討其在UCB中的調(diào)節(jié)機(jī)制和臨床意義。我們首先使用成對(duì)的UCB和正常組織中的circRNA微陣列篩選circRNA表達(dá)譜，然后研究在大量UCB患者中上調(diào)的circRNA（circPRMT5）的臨床意義。最終證實(shí)了circPRMT5的上調(diào)表達(dá)與UCB患者的晚期臨床分期和較差的生存率呈正相關(guān)，circPRMT5通過(guò)海綿miR-30c促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT。

    膀胱尿路上皮癌（UCB）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)率高。大約70％的患者被診斷為非肌肉浸潤(rùn)性腫瘤（NMIBC），30％患有肌肉浸潤(rùn)性腫瘤（MIBC）。50％的MIBC患者在肺，骨骼和肝臟中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良。到目前為止，沒有有效的治療方法可用于腫瘤轉(zhuǎn)移的UCB患者。因此，更好地理解驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生和/或進(jìn)展的分子機(jī)制UCB對(duì)于開發(fā)更有效的抗癌治療是至關(guān)重要的。

    我們使用CircRNA微陣列比較了三對(duì)UCB組織及癌旁組織樣品，火山圖證實(shí)了circRNA表達(dá)的變化。37個(gè)環(huán)狀RNA被上調(diào)，而43個(gè)環(huán)狀RNA被下調(diào)（圖A）。在上調(diào)的circRNA中注意到33個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)基因內(nèi)circRNA，而在下調(diào)的circRNA中注意到35個(gè)外顯子，5個(gè)內(nèi)含子，1個(gè)基因內(nèi)和2個(gè)反義circRNA。前15個(gè)上調(diào)和下調(diào)的circRNA通過(guò)層次聚類顯示（圖B）。

    circRNA_101320被評(píng)估為UCB中最高度上調(diào)的circRNA。通過(guò)瀏覽人類參考基因組，我們發(fā)現(xiàn)circRNA_101320來(lái)自PRMT5，位于染色體14q11.2上，因此我們將其命名為circPRMT5。通過(guò)RT-qPCR，我們驗(yàn)證了與119個(gè)癌旁組織中相比，circPRMT5的表達(dá)在UCB中經(jīng)常過(guò)表達(dá)（圖C）。進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析評(píng)估了UCB中circPRMT5的高表達(dá)與晚期T和N狀態(tài)呈正相關(guān)，并且顯示出較差的無(wú)病生存（DFS）（圖D）。通過(guò)RT-PCR，Sanger測(cè)序（圖E）和Northern印跡（圖F）在T24細(xì)胞中進(jìn)一步分析circPRMT5。用RNA酶R核酸外切酶消化的抗性證實(shí)該RNA種類是圓形的。通過(guò)mRNA分級(jí)（圖G）和熒光原位雜交（FISH）進(jìn)一步檢查（圖H）顯示大多數(shù)circPRMT5優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)中。

    首先構(gòu)建shRNA，用其消耗circPRMT5導(dǎo)致其mRNA水平明顯降低。我們進(jìn)一步檢查了PRMT5的5'鄰近基因，發(fā)現(xiàn)circPRMT5的敲低或circPRMT5的過(guò)表達(dá)對(duì)鄰近基因沒有影響。用短發(fā)夾RNA消耗可顯著抑制UCB細(xì)胞遷移和侵襲能力。UCB 5637細(xì)胞中circPRMT5的異位過(guò)表達(dá)顯著增加細(xì)胞遷移和侵襲能力。隨后，在BALB/c裸鼠尾靜脈靜脈注射T24細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)并用circPRMT5 shRNA對(duì)照，評(píng)估其在體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用，結(jié)果顯示注射circPRMT5 shRNA細(xì)胞的小鼠肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)少于注射對(duì)照細(xì)胞的小鼠。然而，與對(duì)照組相比，注射具有穩(wěn)定過(guò)表達(dá)circPRMT5的細(xì)胞的小鼠顯著增加肺中的腫瘤結(jié)節(jié)。

    Western blot顯示，UCB細(xì)胞中circPRMT5的敲低，上皮標(biāo)志物E-鈣粘蛋白的表達(dá)增加，而間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-鈣粘蛋白的表達(dá)均降低。相反，circPRMT5的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致E-鈣粘蛋白的表達(dá)下調(diào)，并且上調(diào)UCB細(xì)胞中的Vimentin和N-鈣粘蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的免疫熒光（IF）染色證實(shí)上述結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明circPRMT5促進(jìn)了UCB細(xì)胞EMT。此外，我們的結(jié)果顯示宿主基因PRMT5的表達(dá)水平?jīng)]有因UCPR細(xì)胞中circPRMT5的敲低或過(guò)表達(dá)而改變，表明circPRTM5在促進(jìn)EMT中的病理作用不依賴于PRMT5。

    我們首先評(píng)估circPRMT5區(qū)域AGO2的占用情況。通過(guò)對(duì)穩(wěn)定表達(dá)Flag-AGO2和Flag-GFP的T24細(xì)胞中AGO2的RNA免疫沉淀，我們觀察到通過(guò)RT-qPCR分析特異性地富集從Flag-AGO2細(xì)胞下拉的內(nèi)源circPRMT5，表明circPRMT5被摻入進(jìn)入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC復(fù)合物）。為了鑒定與circPRTM5結(jié)合的miRNA，我們用miRNA模擬物庫(kù)進(jìn)行熒光素酶篩選。結(jié)果表明circPRMT5可以作為miR-30c，miR-335，miR-188，miR-377和miR-597這五種miRNA的海綿起作用。接下來(lái)使用生物素標(biāo)記的circPRMT5探針進(jìn)行RNA體內(nèi)沉淀（RIP）找到與其相互作用的真正的miRNA：miR-30c。同時(shí)，RNA-FISH測(cè)定法將內(nèi)源和外源表達(dá)的circPRMT5與miR-30c共定位，從而進(jìn)一步得到證實(shí)。

    我們使用miR-30c的抑制劑來(lái)檢查是否可以通過(guò)miR-30c抑制劑拯救circPRMT5耗盡的作用。結(jié)果顯示，miR-30c抑制劑可以在功能上恢復(fù)circPRMT5沉默抑制的UCB細(xì)胞遷移和侵襲能力。另一方面，miR-30c模擬物可以基本上防止circPRMT5過(guò)表達(dá)增強(qiáng)的UCB細(xì)胞遷移和侵襲。我們的體內(nèi)小鼠模型研究也支持這樣的觀點(diǎn)。我們假設(shè)circPRMT5可能通過(guò)充當(dāng)miR-30c海綿來(lái)增強(qiáng)miR-30c下游靶標(biāo)的表達(dá)水平。使用miRanda分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-30c可以直接靶向SNAIL1的3'非翻譯區(qū)（3'UTR），這是一種促進(jìn)細(xì)胞EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步證明circPRMT5通過(guò)降低海綿活性對(duì)miR-30c的抑制作用來(lái)促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT和侵襲性。

    我們發(fā)現(xiàn)circPRMT5的水平與SYSUCC群組的UCB中的miR-30c表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。此外，在SYSUCC的同一隊(duì)列中，高表達(dá)的circPRMT5與上調(diào)的SNAIL1和下調(diào)的E-鈣粘蛋白顯著相關(guān)，這意味著circPRMT5與UCB患者的EMT進(jìn)展密切相關(guān)。我們?cè)u(píng)估了miR-30c的低表達(dá)與UCB患者中較差的存活顯著相關(guān)，此外，miR-30c的表達(dá)水平在沒有轉(zhuǎn)移的患者中顯著上調(diào)，這與miR-30c在UCB細(xì)胞EMT中的抑制功能一致。此外，miR-30c的表達(dá)水平與UCB患者中SNAIL1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)，高表達(dá)的SNAIL1與低表達(dá)的E-鈣粘蛋白顯著相關(guān)。這些數(shù)據(jù)一起表明，UCB中的miR-30c途徑對(duì)于癌細(xì)胞EMT進(jìn)展是必需的。

    我們收集了來(lái)自71名UCB患者和36名正常人的大量血清，以及來(lái)自18名UCB患者和14名正常人的尿液。在通過(guò)連續(xù)離心分離血清和尿外來(lái)體后，我們通過(guò)幾種方法表征這些囊泡，例如電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡。外泌體標(biāo)志物CD63，TSG101，HSP70和ALIX的高存在證實(shí)了分離的UCB分泌的外泌體在血清和尿液中的純度。RT-qPCR分析顯示，circPRMT5富含源自UCB患者的血清和尿外泌體，UCB中高表達(dá)的circPRMT5可能分泌到腫瘤微環(huán)境中，血清和尿外泌體中高表達(dá)的circPRMT5與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤進(jìn)展呈正相關(guān)。

    在本研究中，我們首次證明circPRMT5是UCB組織中經(jīng)常上調(diào)的重要circRNA，并且circPRMT5的高表達(dá)與UCB患者轉(zhuǎn)移和/或較差的存活率正相關(guān)。其次，從機(jī)理研究中，我們發(fā)現(xiàn)circPRMT5的上調(diào)充當(dāng)了miR-30c的海綿，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)miR-30c調(diào)節(jié)SNAIL1/E-鈣粘蛋白途徑以促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT。第三，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的circPRMT5由外泌體分泌到UCB患者的血清和尿液中，預(yù)測(cè)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。鑒于SNAIL1/E-鈣粘蛋白信號(hào)傳導(dǎo)在癌細(xì)胞EMT進(jìn)展中的重要性，我們的研究結(jié)果首次表明circPRMT5作為人類UCB新治療靶點(diǎn)的重要性。

其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀：lncRNA Atrolnc-1促進(jìn)慢性腎病小鼠的肌肉萎縮(IF:12.511)

文獻(xiàn)解讀：活性依賴性LoNA通過(guò)協(xié)調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化來(lái)調(diào)節(jié)翻譯（12.353）

文獻(xiàn)解讀：MIR100宿主基因編碼的lncRNA通過(guò)調(diào)節(jié)HuR與其靶mRNA之間的相互作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期（11.561）

文獻(xiàn)解讀：基于CRISPRi的基因組規(guī)模鑒定人細(xì)胞中功能性lncRNA（IF:41.058）

文獻(xiàn)解讀：S期富集的lncRNA的泛癌分析鑒定致癌驅(qū)動(dòng)因子和生物標(biāo)志物（IF:12.353）

文獻(xiàn)解讀：H19誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展和進(jìn)展（IF18.88）

文獻(xiàn)解讀：在人類早期發(fā)育過(guò)程lncRNA XACT在控制X染色體活性上與XIST競(jìng)爭(zhēng)（IF:23.290）

文獻(xiàn)解讀：lncRNA lncKdm2b通過(guò)啟動(dòng)Zfp292表達(dá)來(lái)持續(xù)維持ILC3細(xì)胞(IF:21)