A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation

circRNA通過誘導(dǎo)c-myc核轉(zhuǎn)位促進(jìn)腫瘤發(fā)生

期刊：Cell Death Differ.；影響因子：8.00

發(fā)表單位：加拿大多倫多大學(xué)

    本文首次發(fā)現(xiàn)circRNA通過促進(jìn)c-Myc入核，促進(jìn)其發(fā)揮功能，為circRNA功能研究提供了新思路。

    我們在此報(bào)道了源自血管動(dòng)蛋白樣1（circ-Amotl1）的circRNA的致瘤能力。Circ-Amotl1在患者腫瘤樣品和癌細(xì)胞系中高度表達(dá)。使用circ-Amotl1轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞顯示顯著增強(qiáng)的增殖能力集落形成能力。通過研究發(fā)現(xiàn)circ-Amotl1和c-myc之間的相互作用可以觸發(fā)致瘤性。circ-Amotl1的異位表達(dá)增加核c-myc的保留，促進(jìn)c-myc穩(wěn)定性和上調(diào)c-myc靶標(biāo)。我們的研究揭示了circRNA在腫瘤發(fā)生中的新功能，并且這種ncRNA的亞類可能代表癌癥治療中的潛在靶標(biāo)。

    全基因組分析揭示了跨物種的circRNA的高水平豐度和進(jìn)化保守性。circRNA的一種作用方式可能是某些circRNA的miRNA海綿活性，或者一些circRNA可能與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物并調(diào)節(jié)其活性等。本研究旨在探討circ-Amotl1在乳腺癌腫瘤發(fā)生中的潛在作用。

    我們檢測了許多癌癥和癌旁中circRNA的表達(dá)，證實(shí)了一些circRNA的內(nèi)源性表達(dá)，包括由血管生成抑制素結(jié)合蛋白1產(chǎn)生的circRNA（circ-Amotl1，hsa_circ_0004214）。circ-Amotl1由位于11號染色體的Amotl1基因的第三外顯子形成。在乳腺癌標(biāo)本中，circ-Amotl1的表達(dá)量明顯高于癌旁組織。一些常見的腫瘤細(xì)胞系也表現(xiàn)出了circ-Amotl1高表達(dá)的特性。當(dāng)細(xì)胞維持過度匯合時(shí)，circ-Amot1的水平顯著降低，表明circ-Amotl1在細(xì)胞增殖中的作用。分別設(shè)計(jì)針對兩種特異性靶向circ-Amotl1的siRNA，表明沉默circ-Amotl1明顯抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻礙細(xì)胞形成集落的能力。隨后我們產(chǎn)生了circ-Amotl1過表達(dá)構(gòu)建體，并證實(shí)但過表達(dá)circ-Amotl1能顯著提高細(xì)胞增殖能力，抵抗血清饑餓和細(xì)胞凋亡。

    分別在MDA-MB-231 或HepG2細(xì)胞構(gòu)建的裸鼠皮下腫瘤模型中，過表達(dá)circ-Amotl1明顯促進(jìn)腫瘤增殖，腫瘤組織的體積明顯增加。除腫瘤體積的總差異外，我們發(fā)現(xiàn)腫瘤塊與基質(zhì)組織之間存在顯著的粘附。H＆E染色顯示腫瘤細(xì)胞和肌肉之間以及腫瘤細(xì)胞和骨之間的廣泛侵襲。在體外，細(xì)胞侵襲測定證明circ-Amotl1轉(zhuǎn)染通過Matrigel增加了MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力。單細(xì)胞克隆生成實(shí)驗(yàn)也表明過表達(dá)circ-Amotl1明顯促進(jìn)腫瘤克隆生成速度，比對照組快了近30倍。過表達(dá)circ-Amotl1后細(xì)胞倍增時(shí)間縮短至15-18h，明顯高于對照細(xì)胞。通過RNA印跡，我們證實(shí)circ-Amotl1在circ-Amot11轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中高度表達(dá)。

    為了研究circ-Amotl1如何觸發(fā)這種高致瘤性表型，我們進(jìn)行下拉實(shí)驗(yàn)測試了circ-Amtol1與致癌蛋白的潛在相互作用，顯示circ-Amotl1被針對c-myc，EGF，c-myb，NF1和AKT的抗體拉下，其中c-myc顯示出對circ-Amotl1的最大結(jié)合能力，表明c-myc在介導(dǎo)circ-Amotl1功能中的關(guān)鍵作用。我們還檢查了c-myc與其他circRNA之間的相互作用。下拉實(shí)驗(yàn)顯示，針對c-myc的抗體僅沉淀了circ-Amot1，但沒有下調(diào)其他circRNA。然后反復(fù)驗(yàn)證了c-Myc與circ-Amotl1的相互作用情況，特異性靶向circ-Amotl1的環(huán)化位點(diǎn)的探針也可以直接釣取到c-Myc蛋白，說明circ-Amotl1與c-Myc 的相互作用是客觀穩(wěn)定的。

    據(jù)報(bào)道，c-myc可以調(diào)節(jié)高達(dá)15％的基因表達(dá)。在circ-Amotl1和載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分析一些已知c-myc靶標(biāo)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在circ-Amotl1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，許多c-myc靶標(biāo)被上調(diào)。此外，我們發(fā)現(xiàn)異位circ-Amotl1使用擴(kuò)增這些啟動(dòng)子的引物增強(qiáng)了c-myc與HIF-1α，Cdc25a，ELK-1和JUN的啟動(dòng)子的結(jié)合親和力。在c-Myc陰性的HO15.19細(xì)胞中過表達(dá)circ-Amotl1不會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，沉默circ-Amotl1后顯著下調(diào)c-myc靶標(biāo)，驗(yàn)證了c-myc在介導(dǎo)circ-Amotl1功能中的作用。分離亞細(xì)胞組分后鑒定結(jié)果表明circ-Amotl1和c-Myc均主要定位于細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。沉默circ-Amotl1產(chǎn)生相反的c-myc分布模式。原位雜交+免疫熒光實(shí)驗(yàn)也證明circ-Amotl1與c-Myc共定位在細(xì)胞核中。此外高水平的c-myc易位至細(xì)胞核，未檢測到總c-myc水平降低，表明c-myc與circ-Amotl1共定位，防止降解。

    由于全長c-myc的結(jié)構(gòu)尚未闡明，因此使用I-TASSER構(gòu)建了3D模型。使用I-TASSER算法計(jì)算得到5個(gè)c-myc模型以分析潛在的circ-Amotl1結(jié)合位點(diǎn)。使用RNABindRPlus，BindN +和Pprint，我們對RNA結(jié)合殘基進(jìn)行了c-myc的計(jì)算篩選，發(fā)現(xiàn)了c-myc與其他RNA結(jié)合蛋白共享共有序列，預(yù)測了circ-Amotl1與c-myc的結(jié)合位點(diǎn)。接下來，我們誘變了c-myc相互作用位點(diǎn)并設(shè)計(jì)了與結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的封閉寡核苷酸。當(dāng)用突變體構(gòu)建體或阻斷寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，circ-Amotl1探針不再能夠沉淀c-myc，用突變體或阻斷寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出增殖和存活水平降低。隨后小鼠模型中驗(yàn)證了所設(shè)計(jì)的突變分子失去了促進(jìn)腫瘤生成的作用。

    已知circRNA可以作為調(diào)節(jié)miRNA活性的海綿起作用，在目前的研究中，我們檢測到大致相同水平的Amotl1 mRNA和蛋白質(zhì)。這表明circ-Amotl1不起結(jié)合miRNA的海綿的作用。實(shí)際上，為了充當(dāng)海綿，circRNA必須保留在胞質(zhì)溶膠中，并且我們觀察到circ-Amotl1與c-myc相互作用并易位至細(xì)胞核。這些結(jié)果表明Amotl1和circ-Amotl1通過不同的機(jī)制在促進(jìn)癌癥進(jìn)展中起作用。這有待進(jìn)一步調(diào)查。

文獻(xiàn)解讀：circRNA 介導(dǎo)蛋白泛素化過程

文獻(xiàn)解讀：circEPSTI1作為三陰性乳腺癌進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物和介質(zhì)（8.537）

文獻(xiàn)解讀：circRNA ceRNA機(jī)制誘導(dǎo)癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（IF:10.199）

文獻(xiàn)解讀：活性依賴性LoNA通過協(xié)調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化來調(diào)節(jié)翻譯（12.353）

文獻(xiàn)解讀：MIR100宿主基因編碼的lncRNA通過調(diào)節(jié)HuR與其靶mRNA之間的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期（11.561）

文獻(xiàn)解讀：基于CRISPRi的基因組規(guī)模鑒定人細(xì)胞中功能性lncRNA（IF:41.058）

文獻(xiàn)解讀：S期富集的lncRNA的泛癌分析鑒定致癌驅(qū)動(dòng)因子和生物標(biāo)志物（IF:12.353）

文獻(xiàn)解讀：H19誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)展和進(jìn)展（IF18.88）