Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis

circRNA CCDC66的非編碼效應(yīng)促進結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移

期刊：Cancer Res.；影響因子：9.130

發(fā)表單位：國立成功大學

    circRNA可用作miRNA海綿促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

    在這里，我們描述了新型circRNA，circCCDC66在結(jié)直腸癌（CRC）中的功能作用。來自匹配的正常和腫瘤結(jié)腸組織樣品的RNA-Seq數(shù)據(jù)鑒定了癌細胞中特異性升高的多種circRNA，其中幾種通過定量RT-PCR驗證。CRC細胞系中的功能獲得和功能喪失研究表明，circCCDC66控制多種病理過程，包括細胞增殖，遷移，侵襲和不依賴貼壁的生長，其表達在息肉和結(jié)腸癌中升高，并且與預(yù)后不良有關(guān)。深入表征顯示circCCDC66通過調(diào)節(jié)癌基因的子集發(fā)揮其功能，并且circCCDC66的敲低分別抑制異種移植和原位小鼠模型中的腫瘤生長和癌癥侵襲。總之，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了circRNA在癌癥進展和轉(zhuǎn)移中的新的致癌功能。

    結(jié)直腸癌是第三大常見癌癥，2012年新發(fā)病例約為140萬，并且在美國被列為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管進行了深入研究和治療改進，但超過50％的結(jié)腸癌患者最終死于這種疾病，這凸顯了解開導(dǎo)致結(jié)腸癌惡性腫瘤的其他未知機制的必要性。在此，我們的目的是鑒定與結(jié)腸直腸癌臨床相關(guān)的circRNA，并研究這些circRNA在結(jié)直腸癌發(fā)病機制中的作用。

    我們采取了一個有效的方法，篩選了74個環(huán)狀RNA。然后選擇了源自CCDC66的circRNA，因為沒有與其親本基因相關(guān)的已知功能。來自多個細胞系的RT-PCR結(jié)果證明circCCDC66在除了正常細胞外所有測試的結(jié)腸直腸，乳腺，胰腺和宮頸癌細胞系中表達，表明circCCDC66水平升高可能是這些癌癥的腫瘤發(fā)生的一般原因。細胞定位分析顯示，circRNA主要存在于細胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象與外顯子circRNA的特性一致。通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，癌細胞中線性CCDC66的水平較低。在用缺氧處理的癌細胞中線性CCDC66轉(zhuǎn)錄物的水平顯著降低，而環(huán)狀CCDC66轉(zhuǎn)錄物的水平保持不變。這說明瘤內(nèi)的缺氧應(yīng)激能促進circCCDC66積累循環(huán)，并且由于自身的穩(wěn)定性能加強這種積累作用。臨床發(fā)現(xiàn)circCCDC66在癌前息肉組織中高表達，且在腫瘤組織中的水平更高。在不同分期內(nèi)，其在腫瘤中的水平都是高于癌旁組織。結(jié)合生存曲線，發(fā)現(xiàn)circCCDC66與不良預(yù)后相關(guān)，并且其表達水平是CRC檢測和預(yù)后的良好預(yù)測生物標志物。

    我們設(shè)計了兩種siRNA寡核苷酸以靶向獨特的后裂解連接，特異性敲低circCCDC66，但不影響線性CCDC66 mRNA的水平。特異性敲低導(dǎo)致HCT116和HT-29中的細胞數(shù)量顯著減少，其通過抑制細胞增殖介導(dǎo)，但不通過誘導(dǎo)細胞凋亡。此外circCCDC66的敲低顯著減少了細胞遷移、和侵襲。隨后我們使用pCIRC2（circRNA表達載體）來過表達circCCDC66，如通過RT-PCR和Sanger測序所證實的。circCCDC66的過表達顯著增加了軟瓊脂中細胞集落的數(shù)量。此外，BrdU摻入測定顯示過表達circCCDC66刺激DNA合成。

    我們使用CCDC66外顯子8至10進行了miRNA靶序列分析，分析顯示該區(qū)域可能被99個miRNA靶向。根據(jù)三項獨立的全基因組研究GSE63119，GSE46622和GSE43793，在這99種miRNA中，62種在結(jié)腸直腸癌組織中表達。通過分析結(jié)直腸癌中有顯著差異表達的癌基因及腫瘤抑制基因，37.5％的致癌基因具有CRC表達的miRNA的靶向位點，而僅有23.5％的腫瘤抑制基因含有這樣的位點。我們使用過表達和敲除方法操縱circCCDC66的水平，發(fā)現(xiàn)作為預(yù)測的miRNA的靶標的DNMT3B，EZH2，MYC和YAP1的水平被circCCDC66過表達顯著上調(diào)或通過敲低下調(diào)。相反，未被預(yù)測的miRNA靶向的EFNA4和FGF9不受影響。隨后新的體外轉(zhuǎn)錄結(jié)合體內(nèi)環(huán)化方案測試鞏固了circCCDC66作為miRNA海綿的作用。另外，實驗表明在過表達circCCDC66時，MYC（circCCDC66上調(diào)蛋白）其3′-UTR區(qū)活性增強（miRNAs吸附減少）。敲減circCCDC66后發(fā)現(xiàn)MYC mRNA表達顯著減低。Rescue實驗（加入miR-33b、miR-93抑制劑）后則能回復(fù)MYC mRNA水平。這些結(jié)果均表明circCCDC66能作為miRNA的海綿，調(diào)控MYC表達。

    我們將具有或不具有瞬時circCCDC66敲低的HCT116細胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的背側(cè)，并使其增殖四周。用circCCDC66敲低的HCT116接種的腫瘤的生長被顯著抑制。此外，將具有或不具有瞬時circCCDC66敲低的HCT116細胞原位接種于NOD/SCID小鼠的盲腸中并使其增殖四周。對照組細胞形成的腫瘤積極地破壞平滑肌的襯里并插入肌細胞。相反，來自具有circCCDC66敲低的細胞的腫瘤通常沿平滑肌層的邊緣保留明顯的邊界。HCC116細胞在肝臟中形成結(jié)節(jié)的能力，可能是由于腫瘤從盲腸到肝臟的轉(zhuǎn)移，用circCCDC66敲低顯著降低。使用對泛角蛋白特異性的抗體的免疫組織化學染色顯示轉(zhuǎn)移的細胞確實是上皮細胞而不是肝細胞。

    總之，我們鑒定了一組在結(jié)直腸癌中表達的新型circRNA，其中，circCCDC66與治療結(jié)果呈負相關(guān)。 CircCCDC66可用作海綿，保護多種癌基因免受miRNA的攻擊。我們發(fā)現(xiàn)一個circRNA含有不同miRNA的不同結(jié)合位點，揭示了circRNA在癌癥惡性腫瘤中的復(fù)雜作用，并強調(diào)了研究復(fù)雜的circRNA-miRNA調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò)在癌癥進展和治療效果中的重要性。這是第一份徹底研究circCCDC66在人類癌癥中的表達，調(diào)控，功能和臨床意義的報告。

其他相關(guān)文獻解讀

文獻解讀：circRNA誘導(dǎo)C-myc進入細胞核促進腫瘤發(fā)生（IF:8.00）

文獻解讀：circRNA 介導(dǎo)蛋白泛素化過程

文獻解讀：circEPSTI1作為三陰性乳腺癌進展的預(yù)后標志物和介質(zhì)（8.537）

文獻解讀：circRNA ceRNA機制誘導(dǎo)癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（IF:10.199）

文獻解讀：活性依賴性LoNA通過協(xié)調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化來調(diào)節(jié)翻譯（12.353）

文獻解讀：MIR100宿主基因編碼的lncRNA通過調(diào)節(jié)HuR與其靶mRNA之間的相互作用來調(diào)節(jié)細胞周期（11.561）

文獻解讀：基于CRISPRi的基因組規(guī)模鑒定人細胞中功能性lncRNA（IF:41.058）

文獻解讀：S期富集的lncRNA的泛癌分析鑒定致癌驅(qū)動因子和生物標志物（IF:12.353）