circEPSTI1 as a Prognostic Marker and Mediator of Triple-Negative Breast Cancer Progression

circEPSTI1作為三陰性乳腺癌進(jìn)展的預(yù)后標(biāo)志物和介質(zhì)

期刊：Theranostics；影響因子：8.537

發(fā)表單位：中山大學(xué)

    circEPSTI1-miR-4753/6809-BCL11A軸通過競爭內(nèi)源性RNAs（ceRNA）的機制影響三陰性乳腺癌的增殖和凋亡。

    我們研究了人類circRNA在三陰性乳腺癌（TNBC）組織中的表達(dá)譜，并鑒定了circEPSTI1（hsa_ circRNA_000479）作為顯著上調(diào)的circRNA。我們進(jìn)行環(huán)狀RNA微陣列分析以篩選TNBC的環(huán)狀RNA表達(dá)譜，并進(jìn)一步研究circEPSTI1。通過敲低三種TNBC細(xì)胞系中的circEPSTI1，觀察了circEPSTI1對TNBC增殖，克隆形成和凋亡的影響?；?/span>MRE分析和熒光素酶報告基因測定，我們發(fā)現(xiàn)circEPSTI1作為miRNA海綿與miR-4753和miR-6809結(jié)合，以調(diào)節(jié)BCL11A表達(dá)并影響TNBC增殖和凋亡。高水平的circEPSTI1與TNBC患者的存活率降低相關(guān)。

    三陰性乳腺癌（TNBC）是最具侵襲性的乳腺癌亞型，表現(xiàn)出復(fù)發(fā)增加和存活率降低。大約15％至20％的乳腺癌病例被歸類為此亞型。由于缺乏藥物分子靶點，與管腔或HER2 +亞型的治療相比，TNBC治療非常有限。因此，人們對獲得更好的治療效果非常感興趣。了解TNBC預(yù)后，開發(fā)新的預(yù)后標(biāo)志物并鑒定新的抗癌分子靶點。

    我們使用三對TNBC患者樣品進(jìn)行了高通量環(huán)狀RNA微陣列測定，層次聚類揭示了環(huán)狀RNA表達(dá)模式。在火山中顯示了環(huán)狀RNA表達(dá)的變化（圖B）和散點圖（圖C）。結(jié)果，173個環(huán)狀RNA上調(diào)，77個下調(diào)。差異表達(dá)的環(huán)狀RNA在人染色體上的分布如圖D所示。在增加的circRNA中總共注意到150個外顯子，8個內(nèi)含子，12個有義重疊和3個反義circRNA，并且在減少的circRNA中注意到66個外顯子，4個內(nèi)含子，6個有義重疊和1個反義circRNA（圖E）。鑒于環(huán)狀RNA主要來自外顯子，大多數(shù)差異表達(dá)的環(huán)狀RNA由外顯子轉(zhuǎn)錄。我們進(jìn)一步證實了通過qRT-PCR在10個配對的TNBC組織和匹配的正常組織中的四個circRNA的微陣列結(jié)果。

    circRNA_000479是上調(diào)最顯著的circRNA。我們假設(shè)circRNA_000479來自EPSTI1，其位于染色體13q14上，將circRNA_000479稱為“circEPSTI1”，其通過向外引物擴增并通過Sanger測序確認(rèn)（圖F）。我們在一組12個乳腺細(xì)胞系中測試了circEPSTI1表達(dá)水平，如圖A所示，circEPSTI1水平在7種人乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)，特別是在TNBC細(xì)胞系中。此外，通過核和細(xì)胞質(zhì)RNA的qRT-PCR分析評估，circEPSTI1優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。RNase R核酸外切酶對消化的抗性進(jìn)一步證實該RNA種類是圓形的（圖I）。

    我們使用RNA干擾來沉默三種TNBC細(xì)胞系中circEPSTI1的表達(dá)，觀察發(fā)現(xiàn)circEPSTI1的下調(diào)顯著抑制了三種TNBC細(xì)胞系的生長。在集落形成測定中，下調(diào)circEPSTI1表達(dá)，三種TNBC細(xì)胞系的集落形成能力顯著降低。此外，我們使用EdU分析來評估增殖潛力。隨著circEPSTI1表達(dá)的下調(diào)，TNBC細(xì)胞增殖受損。接下來，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48小時，通過膜聯(lián)蛋白V-FITC/碘化丙啶染色測量細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明circEPSTI1沉默誘導(dǎo)TNBC細(xì)胞系中的細(xì)胞凋亡。

    根據(jù)MRE分析，根據(jù)circEPSTI1序列中推定的結(jié)合位點的位置，前5個miRNA是miR-942，miR-4753，miR-6809，miR-6873和miR-6739。用每種miRNA模擬物和熒光素酶報告基因共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞用于熒光素酶活性測定。響應(yīng)于miR-4753和miR-6809模擬物，熒光素酶強度降低超過50％。而miRNA模擬物和突變的熒光素酶報告基因的共轉(zhuǎn)染對熒光素酶活性沒有顯著影響。此外，qRT-PCR分析顯示miR-4753和miR-6809沒有顯著降低circEPSTI1的水平，表明circEPSTI1不被miR-4753和miR-6809消化。這些數(shù)據(jù)表明circEPSTI1可以作為miR-4753和miR-6809的海綿。

    我們首先使用三種算法預(yù)測miR-4753和miR-6809的共靶基因為BCL11A。將熒光素酶報告載體單獨或與miR-4753，miR-6809或兩者一起轉(zhuǎn)染到HEK 293T中。然后進(jìn)行qRT-PCR和Western印跡分析以確認(rèn)熒光素酶測定結(jié)果。結(jié)果顯示miR-4753和miR-6809沒有改變mRNA水平，但與陰性對照相比，注意到BCL11A蛋白水平的顯著降低。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲低circEPASTI1也降低了BCL11A蛋白水平。

    我們將用亂序或si-cEPSTI1-1 siRNA處理的MDA-MB-231，BT549和MDA-MB-468細(xì)胞皮下注射到裸鼠中。在連續(xù)腫瘤內(nèi)注射兩周后，結(jié)果顯示，與三種皮下移植模型中的爭奪陰性對照相比，敲低circEPSTI1減少了腫瘤體積和腫瘤重量。此外，免疫組織化學(xué)檢測各組移植腫瘤組織中BCL11A，caspase-3和Ki67蛋白的表達(dá)。BCL11A和Ki67的表達(dá)顯著降低，而si-cEPSTI1-1組的腫瘤組織中caspase-3表達(dá)增加。

    ISH分析顯示34.6％（83/240）的腫瘤樣品表現(xiàn)出高的circEPSTI1表達(dá)水平，而IHC分析顯示29.6％的腫瘤樣品表現(xiàn)出高的BCL11A表達(dá)。增加的circEPSTI1表達(dá)與TNBC組織中的BCL11A表達(dá)正相關(guān)。然后，我們分析circEPSTI1表達(dá)與TNBC患者臨床病理狀態(tài)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)circEPSTI1表達(dá)與TNBC的腫瘤大小，浸潤淋巴結(jié)和TNM分期呈正相關(guān)。此外，我們分析了circEPSTI1和BCL11A在臨床預(yù)后方面的意義，使用患者無病生存（DFS）和總生存（OS）進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。結(jié)果顯示，與具有低circEPSTI1表達(dá)的患者相比，具有高circEPSTI1表達(dá)的患者表現(xiàn)出DFS和OS的平均月減少。此外，具有高circIFPS1和BCL11A表達(dá)的患者與DFS和OS減少顯著相關(guān)。

    鑒于生物信息學(xué)和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，CircRNA已被越來越多地研究，但許多問題仍未得到解決。除了一些眾所周知的circRNA，如CiRS-7和circSRY，大多數(shù)circRNA的功能仍然未知。此外，關(guān)于circRNA在乳腺癌中的作用知之甚少，特別是在三陰性乳腺癌中。據(jù)我們所知，這是關(guān)于TNBC中circRNA的表達(dá)譜和調(diào)節(jié)功能的第一份報告。對circRNA的進(jìn)一步研究和關(guān)注將有助于我們更好地了解TNBC的進(jìn)展，并為TNBC的生物標(biāo)志物或潛在治療靶點的鑒定提供新的見解。

其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀：circRNA ceRNA機制誘導(dǎo)癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（IF:10.199）

文獻(xiàn)解讀：活性依賴性LoNA通過協(xié)調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化來調(diào)節(jié)翻譯（12.353）

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