Activity dependent LoNA regulates translation by coordinating rRNA transcription and methylation

活性依賴性LoNA通過協(xié)調(diào)rRNA轉(zhuǎn)錄和甲基化來調(diào)節(jié)翻譯

期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影響因子：12.353

發(fā)表單位：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)

    長核仁特異性lncRNA LoNA在調(diào)節(jié)rRNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾中起關(guān)鍵作用，其還可以調(diào)節(jié)突觸可塑性，抑制其表達(dá)可改善WT小鼠的學(xué)習(xí)和記憶，并挽救APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和記憶受損。

    核糖體對于精確控制蛋白質(zhì)合成的能力是必不可少的。然而，如何協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)化機(jī)制以滿足轉(zhuǎn)化需求仍然是難以捉摸的。在這里，我們鑒定核仁特異性lncRNA（LoNA），其5'部分結(jié)合并隔離核仁蛋白以抑制rRNA轉(zhuǎn)錄，其snoRNA如3'末端募集并減少纖維蛋白活性以減少rRNA甲基化。LoNA的活性依賴性降低導(dǎo)致rRNA和核糖體水平升高，多核糖體比例增加，mRNA多核苷酸負(fù)載和蛋白質(zhì)翻譯。此外，特別促進(jìn)核糖體向突觸的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致AMPA/NMDA受體水平增加，突觸可塑性增強(qiáng)，長期增強(qiáng)和鞏固記憶。引人注目的是，海馬LoNA缺乏不僅增強(qiáng)了WT小鼠的長期記憶，還恢復(fù)了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶功能受損?？傊@些發(fā)現(xiàn)揭示了LoNA在調(diào)節(jié)核糖體生物發(fā)生中的多方面作用，以滿足長期記憶的轉(zhuǎn)化需求。

    已知神經(jīng)元活性通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，包括關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，rRNA和mRNA的加工和成熟，以及核仁數(shù)的控制。核仁數(shù)量在神經(jīng)元的整個(gè)發(fā)育過程中不同，表明通過調(diào)節(jié)核仁組裝來適應(yīng)神經(jīng)元對蛋白質(zhì)合成的需求的變化。rRNA是核糖體的RNA組分，對于所有生物體中的蛋白質(zhì)合成是必需的。神經(jīng)元的刺激增加rRNA產(chǎn)生，并且rRNA合成減少和核仁破壞是與衰老和神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的細(xì)胞應(yīng)激的主要跡象。這些觀察結(jié)果表明核仁和核糖體RNA生物發(fā)生的重要作用涉及學(xué)習(xí)和記憶，以及神經(jīng)疾病。

    我們使用Morris水迷宮檢測了經(jīng)驗(yàn)誘導(dǎo)的記憶形成小鼠的rRNA水平，與對照組相比，訓(xùn)練小鼠的前rRNA和成熟rRNA水平均顯著升高（圖a），表明rRNA轉(zhuǎn)錄和/或加工在活動(dòng)依賴性學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮重要作用。從N2a細(xì)胞中分離出核仁RNA，去除rRNA進(jìn)行高通量RNA測序。9.9％的表達(dá)轉(zhuǎn)錄物被鑒定為mRNA，其余90.1％被注釋為lncRNA（圖b，c），表明lncRNA比核仁中的蛋白質(zhì)編碼RNA豐富得多。通過qPCR驗(yàn)證了30種最豐富的lncRNA的表達(dá)水平（圖d）。為了進(jìn)一步表征這些lncRNA的功能，我們接下來測量了它們在經(jīng)受Morris水迷宮訓(xùn)練的小鼠的海馬腦中的表達(dá)水平（圖e），以及活化的培養(yǎng)神經(jīng)元（圖f）。我們的目的是鑒定那些在受過訓(xùn)練的小鼠中水平顯著降低，并且在活化的培養(yǎng)神經(jīng)元中顯示出時(shí)間依賴性降低的lncRNA。使用這些標(biāo)準(zhǔn)，我們鑒定了一個(gè)lncRNA，GM17382，它是高度的在海馬腦中表達(dá)，在神經(jīng)元中特別豐富。

    通過免疫染色和FISH成像顯示GM17382與polR1E共定位，表明它在核仁中特異性富集。因此，我們將其重命名為LoNA。用各種聚合酶抑制劑治療表明LoNA轉(zhuǎn)錄依賴于polII，但不依賴于polI或polIII。用LoNA直接轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞以模擬過表達(dá)，或用LoNA shRNA或反義寡聚物（ASO）轉(zhuǎn)染以抑制LoNA表達(dá)。除qPCR外，通過Northern印跡驗(yàn)證LoNA表達(dá)水平。成熟rRNA的Northern印跡分析顯示，響應(yīng)施用LoNA，rRNA的水平顯著降低并且當(dāng)LoNA被抑制時(shí)增加，表明LoNA在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)rRNA。為了評估LoNA是否影響翻譯，我們用LoS或?qū)φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞，用35S-Met/Cys作為從頭蛋白質(zhì)合成的測量，并發(fā)現(xiàn)LoNA過表達(dá)的N2a細(xì)胞顯示出顯著降低的蛋白質(zhì)合成率，而LoNA敲低細(xì)胞顯示出增加的蛋白質(zhì)合成率，表明LoNA抑制rRNA轉(zhuǎn)錄和隨后的蛋白質(zhì)翻譯。

    我們進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)以鑒定LoNA通過SDS-PAGE和隨后的質(zhì)譜（MS）結(jié)合蛋白質(zhì)。這些測定揭示LoNA與核仁蛋白（NCL）結(jié)合。接下來我們產(chǎn)生了針對結(jié)合基序中的一個(gè)或兩個(gè)（M1，M2和M1+M2）的LoNA突變體。然后進(jìn)行生物素化RNA的下拉，發(fā)現(xiàn)LoNA主要通過M1結(jié)合位點(diǎn)與NCL結(jié)合。此外，將含有2kb rDNA啟動(dòng)子區(qū)段的熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到具有LoNA或突變體LoNA的N2a細(xì)胞中，熒光素酶活性表明LoNA，而不是LoNA M1突變體，抑制rDNA啟動(dòng)子活性。此外，LoNA過表達(dá)減少了UEC上的RNA聚合酶（Pol）I負(fù)載，在NCL缺陷細(xì)胞中觀察到類似的變化?？傊?，這些觀察結(jié)果表明，增加的LoNA導(dǎo)致rDNA啟動(dòng)子和編碼區(qū)中的無活性染色質(zhì)狀態(tài)，以及UCE和核心啟動(dòng)子區(qū)域上的UBF和PolI負(fù)載降低。這些發(fā)現(xiàn)還表明，LoNA對染色質(zhì)狀態(tài)的影響是通過與NCL結(jié)合來減少其活性而不是其表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

    MS分析還鑒定了纖維蛋白（FBL）作為推定的LoNA結(jié)合蛋白。snoRNA作為小核仁核糖核蛋白顆粒復(fù)合物（snoRNP）的一部分具有活性，其中框C和框D形成功能性結(jié)構(gòu)以募集FBL并促進(jìn)rRNA甲基化。FISH和免疫染色表明LoNA與FBL共定位。RNA免疫沉淀和RNA pull-down進(jìn)一步證明FBL與LoNA相關(guān)。這些觀察表明LoNA與snoRNPs復(fù)合物相互作用。生物素化的Mut或Del LoNA pull-down測定顯示LoNA通過其盒式C/D序列與U3競爭性地結(jié)合FBL。用WT，Mut或Del LoNA轉(zhuǎn)染N2a細(xì)胞用于過表達(dá)，或用shRNA進(jìn)行敲低。觀察到LoNA Mut或Del的施用對rRNA甲基化沒有影響，表明rRNA甲基化狀態(tài)由LoNA通過其盒C/D結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)，并表明snoRNP功能相應(yīng)地被調(diào)節(jié)。具有FBL敲低的N2a細(xì)胞中的rRNA甲基化水平（陽性對照）在表型上類似于具有LoNA過表達(dá)的N2a細(xì)胞。

    我們進(jìn)行了多核糖體分析測定以監(jiān)測細(xì)胞質(zhì)翻譯，并發(fā)現(xiàn)LoNA耗盡的N2a細(xì)胞表現(xiàn)出增加的多核糖體比例，表明LoNA降低了翻譯效率。我們接下來分別檢測了核糖體結(jié)合的突觸素和突觸后密度-95（PSD95）mRNA的水平，觀察到來自LoNA敲低的N2a細(xì)胞的多重分子中兩者的顯著增加。接下來，我們敲除或過表達(dá)LoNA，包括同時(shí)包含M1突變體和盒C/D Del的突變體LoNA，特別是在海馬腦中（AAV）使用腺病毒相關(guān)的傳遞技術(shù)。從這些小鼠的海馬腦中純化突觸體，通過蛋白質(zhì)印跡測定突觸蛋白以及AMPA和NMDA受體的水平。我們的結(jié)果顯示突觸蛋白突觸素，snap25，PSD95，AMPA受體GluA2，NMDA受體NR1，NR2A和NR2B的水平在從LoNA敲低小鼠分離的突觸體部分中顯著升高，在LoNA-過表達(dá)的小鼠中降低并且在突變體LoNA-受體小鼠中未改變。這些觀察結(jié)果表明，LoNA，但不是突變體LoNA，調(diào)節(jié)突觸可塑性。

    在探針試驗(yàn)期間，與對照相比，LoNA敲低小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限，其中平臺(tái)已經(jīng)在訓(xùn)練期間定位，顯著更頻繁并且花費(fèi)相當(dāng)少的時(shí)間定位該目標(biāo)象限。相反，在海馬腦中施用LoNA的小鼠表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)和記憶受損，并且接受突變體LoNA的小鼠表現(xiàn)出與對照相似的表現(xiàn)，表明海馬LoNA深入?yún)⑴c學(xué)習(xí)和記憶。阿爾茨海默?。?/span>AD）患者表現(xiàn)出降低的rRNA產(chǎn)生。8個(gè)月大的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的學(xué)習(xí)和記憶障礙，并代表AD的動(dòng)物模型。我們通過AAV傳遞系統(tǒng)敲除APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬腦中的LoNA，并進(jìn)行Morris水迷宮和對象-背景辨別行為測試。這些研究表明，與對照APP/PS1小鼠相比，LoNA缺陷的APP/PS1小鼠顯示出挽救的學(xué)習(xí)和記憶缺陷。此外，發(fā)現(xiàn)rRNA水平恢復(fù)。我們的研究結(jié)果表明，LoNA在神經(jīng)退行性疾病中起著關(guān)鍵作用，可能代表了治療AD的有希望的治療靶點(diǎn)。

    我們發(fā)現(xiàn)長核仁特異性lncRNA（LoNA），其抑制核仁中rRNA的產(chǎn)生和核糖體生物合成，并最終抑制蛋白質(zhì)合成。從機(jī)制上講，我們顯示LoNA的5'部分含有核仁蛋白（NCL）結(jié)合位點(diǎn)并特異性結(jié)合NCL。我們證明LoNA通過減弱NCL的轉(zhuǎn)錄活性來降低rRNA水平，并且還通過減少FBL活性降低rRNA 2'-O-甲基化，一起導(dǎo)致抑制rRNA產(chǎn)生和改變核糖體異質(zhì)性。LoNA敲低不僅能夠改善WT小鼠的記憶，還能夠功能性地挽救AD模型小鼠受損學(xué)習(xí)和記憶的表型。

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