Long-noncoding RNA Atrolnc-1 promotes muscle wasting in mice  with chronic kidney disease

長(zhǎng)鏈非編碼RNA Atrolnc-1促進(jìn)慢性腎病小鼠的肌肉萎縮

期刊：J Cachexia Sarcopenia Muscle；影響因子：12.511       

發(fā)表單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院              

   lncRNA Atrolnc-1與內(nèi)源性NF-κB抑制劑ABIN-1相互作用，這種結(jié)合阻礙了ABIN-1抑制功能，導(dǎo)致NF-κB活化，從而增加MuRF-1表達(dá)和肌肉蛋白水解。

   慢性腎病（CKD）通常與惡病質(zhì)相關(guān)，惡病質(zhì)是導(dǎo)致骨骼肌萎縮和不利預(yù)后的病癥。盡管已經(jīng)深入研究了導(dǎo)致惡病質(zhì)的機(jī)制，但生物學(xué)知識(shí)和技術(shù)的進(jìn)步促使我們?cè)诶斫膺@種疾病的發(fā)病機(jī)理方面取得進(jìn)展。我們的研究結(jié)果提供證據(jù)表明lncRNAs啟動(dòng)了肌肉萎縮的病理生理過(guò)程。Atrolnc-1和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)之間的相互作用調(diào)節(jié)CKD中的肌肉質(zhì)量和蛋白水解以及可能的其他分解代謝條件。

   肌肉萎縮被定義為骨骼肌質(zhì)量的減少，這是慢性疾病預(yù)后的重要指標(biāo)。在CKD或其他分解代謝條件下肌肉萎縮是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，由于IGF-1 /胰島素信號(hào)傳導(dǎo)受損，代謝應(yīng)激，糖皮質(zhì)激素升高和炎癥而發(fā)生。雖然在理解肌肉蛋白質(zhì)丟失方面取得了重大進(jìn)展，背后的分子和細(xì)胞機(jī)制仍在被發(fā)現(xiàn)。在目前的研究中，我們致力于發(fā)現(xiàn)惡病質(zhì)相關(guān)的lncRNA，并確定它們?cè)诩∪馕s中的功能。我們鑒定了lncRNA，1110038 B12Rik在肌肉萎縮的各種小鼠模型的肌肉中持續(xù)上調(diào)。由于這種lncRNA的過(guò)表達(dá)刺激了MuRF-1的表達(dá)和肌肉萎縮，我們將其改名為萎縮相關(guān)的長(zhǎng)非編碼RNA-1（Atrolnc-1）。我們發(fā)現(xiàn)Atrolnc-1與ABIN-1相互作用，導(dǎo)致NF-κB活性增強(qiáng)和MuRF-1表達(dá)增強(qiáng)。這些結(jié)果為MuRF-1調(diào)節(jié)增加了新的復(fù)雜層，并擴(kuò)展了肌肉萎縮期間蛋白水解的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)譜。

   為了確定lncRNAs是否在肌肉萎縮中差異表達(dá)，我們?cè)趤?lái)自三種分解代謝條件（包括CKD，饑餓（STV）和癌癥）的小鼠模型的四頭肌中進(jìn)行了基于PCR的lncRNA陣列（RT2 lncRNA PCR Array）分析。我們發(fā)現(xiàn)幾種lncRNA在具有分解代謝條件的小鼠的肌肉中差異表達(dá)（圖1A）。我們進(jìn)一步確定了來(lái)自三種小鼠分解代謝模型的萎縮肌肉中8種lncRNA的表達(dá)同時(shí)升高，其中1110038 B12Rik是增強(qiáng)最強(qiáng)的lncRNA；同時(shí)，來(lái)自三種分解代謝模型的肌肉中9種lncRNA的表達(dá)被下調(diào)（圖1B）。使用實(shí)時(shí)定量PCR，我們證實(shí)1110038B12Rik在骨骼肌中大量表達(dá)，并且其表達(dá)在由CKD，STV和癌癥引起的萎縮肌肉中顯著增加（圖1C）。因?yàn)?/span>1110038 B12Rik響應(yīng)肌肉萎縮而增加。

   我們首先研究了胰島素如何影響血清饑餓的C2C12肌管中Atrolnc-1的表達(dá)，無(wú)論其是否含有胰島素。通過(guò)血清耗竭24小時(shí)顯著增加Atrolnc-1表達(dá)，而添加胰島素或IGF-1消除了由血清耗竭刺激的Atrolnc-1水平。通過(guò)分析Atrolnc-1的啟動(dòng)子區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-α有許多結(jié)合位點(diǎn)。這促使我們研究C/EBP-α是否促進(jìn)Atrolnc-1的表達(dá)，我們將熒光素酶報(bào)告基因（Luc-Atrolnc-1）含有Atrolnc-1啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到C2C12成肌細(xì)胞中，24小時(shí)后，用血清耗竭或C/EBP-α過(guò)表達(dá)處理細(xì)胞。如所預(yù)期的，C/EBP-α的血清耗竭或過(guò)表達(dá)強(qiáng)烈刺激C2C12細(xì)胞中的Atrolnc-1啟動(dòng)子活性。然后我們進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)定以證實(shí)C/EBP-α與Atrolnc-1的啟動(dòng)子區(qū)域相關(guān)。血清耗竭富集了在抗C/EBP-α抗體下拉的免疫沉淀物中含有C/EBP-α結(jié)合位點(diǎn)的啟動(dòng)子DNA片段。值得注意的是，添加胰島素（2μg/mL）降低了免疫沉淀物中啟動(dòng)子DNA片段的量，表明胰島素阻斷了C/EBP-α與Atrolnc-1啟動(dòng)子的結(jié)合。這些結(jié)果表明，CKD或STV小鼠中發(fā)生的抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)刺激C/EBP-α促進(jìn)肌肉中Atrolnc-1的表達(dá)。

   我們構(gòu)建了攜帶Atrolnc-1 cDNA或shRNA的兩種AAV1（腺相關(guān)病毒同種型1，其與骨骼肌細(xì)胞具有高親和力），分別用于過(guò)表達(dá)或敲除Atrolnc-1。用載有Atrolnc-1 cDNA的AAV1轉(zhuǎn)染C2C12肌管48小時(shí)，與用對(duì)照AAV1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，Atrolnc-1 RNA增加3倍。我們發(fā)現(xiàn)Atrolnc-1的過(guò)表達(dá)沒(méi)有改變蛋白質(zhì)合成的速率，但是與用對(duì)照AAV1轉(zhuǎn)染的肌管的結(jié)果相比，顯著增加了肌管中蛋白質(zhì)降解的速率。

    當(dāng)AAV1攜帶shRNA轉(zhuǎn)染的C2C12肌管48小時(shí)時(shí)，與用對(duì)照shRNA轉(zhuǎn)染的肌管相比，它有效地降低了Atrolnc-1 RNA的水平。在Atrolnc-1敲低后，蛋白質(zhì)合成速率沒(méi)有受到顯著影響。我們還發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降解不受影響，然而，當(dāng)用血清耗盡處理肌管時(shí)，通過(guò)敲低Atrolnc-1顯著抑制蛋白質(zhì)降解的速率。值得注意的是，Atrolnc-1敲低在用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后沒(méi)有改變C2C12肌管中p-Akt的水平。這些結(jié)果表明Atrolnc-1刺激肌肉蛋白質(zhì)降解。

   我們使用C2C12肌管中的'肌生成和肌病PCR陣列'來(lái)分析基因表達(dá)。首先，我們用Atrolnc-1敲低檢測(cè)了這些基因在肌管中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因被上調(diào)，而11個(gè)基因響應(yīng)于Atrolnc-1敲低而下調(diào)。在下調(diào)基因中，MuRF-1，介導(dǎo)肌肉蛋白水解的主要蛋白E3連接酶顯著減少。我們?cè)诰哂?/span>Atrolnc-1過(guò)表達(dá)的肌管中進(jìn)行相同的PCR陣列，超過(guò)20％的測(cè)試基因被上調(diào)，包括MuRF-1。使用蛋白質(zhì)印跡，我們證實(shí)Atrolnc-1過(guò)表達(dá)顯著刺激了C2C12肌管中MuRF-1的表達(dá)。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)Atrolnc-1在肌管中的表達(dá)隨著血清耗竭（<6 h）而迅速增加，比誘導(dǎo)MuRF-1早得多，表明Atrolnc-1可能在誘導(dǎo)MuRF-1表達(dá)中起到因果作用。這些結(jié)果表明Atrolnc-1在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)MuRF-1表達(dá)。通過(guò)使用KEGG途徑富集分析，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)是響應(yīng)Atrolnc-1過(guò)表達(dá)或敲低的最豐富的途徑之一。使用蛋白質(zhì)印跡，我們檢測(cè)到在Atrolnc-1過(guò)表達(dá)48小時(shí)后C2C12細(xì)胞的核部分中NF-κB（p65）顯著增加。NF-κB活性測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)Atrolnc-1的過(guò)表達(dá)激活C2C12肌管中的NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。這些結(jié)果表明Atrolnc-1可以促進(jìn)肌肉細(xì)胞中的NF-κB活性。

   我們進(jìn)行了RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)Atrolnc-1 RNA位于C2C12細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表明其在基因調(diào)控中具有多重潛在作用。然后我們使用C2C12肌管的細(xì)胞質(zhì)或核提取物進(jìn)行RNA pull-down測(cè)定以及質(zhì)譜法以鑒定可能與Atrolnc-1相互作用的蛋白質(zhì)。其中一個(gè)是細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)ABIN-1，一種據(jù)報(bào)道抑制NF-κB信號(hào)的蛋白質(zhì)。我們通過(guò)使用針對(duì)ABIN-1的抗體的免疫印跡證實(shí)了ABIN-1和Atrolnc-1之間相互作用的特異性。值得注意的是，我們觀察到來(lái)自CKD小鼠的肌肉中Atrolnc-1和ABIN-1之間的相互作用增加，表明CKD可以刺激Atrolnc-1與ABIN-1的相互作用。我們使用CRISPR/dCas9介導(dǎo)的協(xié)同激活介質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)產(chǎn)生了用于過(guò)表達(dá)ABIN-1的穩(wěn)定C2C12細(xì)胞系。當(dāng)這些轉(zhuǎn)導(dǎo)的C2C12細(xì)胞用Atrolnc-1過(guò)表達(dá)時(shí)，與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照細(xì)胞也具有Atrolnc-1過(guò)表達(dá)的結(jié)果相比，NF-κB活性沒(méi)有顯著增加。這些結(jié)果表明ABIN-1過(guò)表達(dá)可以克服Atrolnc-1刺激的NF-κB活化。伴隨這些變化，盡管Atrolnc-1上調(diào)，但MuRF-1表達(dá)也被ABIN-1過(guò)表達(dá)抑制?；谶@些觀察，我們提出Atrolnc-1阻礙ABIN-1的抑制能力，導(dǎo)致增強(qiáng)的NF-κB活性和MuRF-1轉(zhuǎn)錄。

   我們首先驗(yàn)證了AAV1在骨骼肌中的轉(zhuǎn)染效率。在TA肌肉中注射AAV1-GFP 14天后，我們檢測(cè)到超過(guò)80％的肌纖維表達(dá)GFP。然后我們將AAV1-Atrolnc-1注射到正常C57BL/6小鼠的TA肌肉中，與注射對(duì)照AAV1的肌肉相比，Atrolnc-1 RNA顯著增加。通過(guò)TA肌肉中的原位雜交證實(shí)Atrolnc-1的過(guò)表達(dá)。與注射對(duì)照AAV1-shRNA的肌纖維的結(jié)果相比，肌纖維中的Atrolnc-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致纖維橫截面積（CSA）減少約25％。這一結(jié)果通過(guò)Atrolnc-1過(guò)表達(dá)的肌纖維中CSAs分布的向左移動(dòng)得到證實(shí)。我們還檢測(cè)到與注射AAV1-對(duì)照的肌肉的結(jié)果相比，MuRF-1表達(dá)增加。因此，即使在正常小鼠中，Atrolnc-1過(guò)表達(dá)也足以引起肌纖維萎縮，突出其在肌肉蛋白質(zhì)代謝中的分解代謝作用。

   在患有CKD的小鼠中使用AAV1介導(dǎo)的基因敲低來(lái)測(cè)試抑制Atrolnc-1是否能減輕CKD小鼠的肌肉萎縮。在腎次全切除術(shù)后3周將AAV1-shAtrolnc-1注射到小鼠的TA肌肉中。然后將小鼠配對(duì)喂養(yǎng)3周，然后檢查TA肌肉。與注射對(duì)照AAV1的CKD小鼠的結(jié)果相比，Atrolnc-1的RNA水平降低了多達(dá)76％。在CKD小鼠中，TA肌肉重量與脛骨長(zhǎng)度的比值顯著降低；相反，在用AAV1-shAtrolnc-1處理的CKD小鼠中，這種肌肉萎縮指數(shù)顯著改善，表明盡管CKD，Atrolnc-1的抑制仍防止小鼠骨骼肌質(zhì)量損失。這種改善通過(guò)肌纖維的CSA增加和TA肌肉中肌纖維尺寸分布的向右移動(dòng)得到證實(shí)。伴隨這些結(jié)果，具有Atrolnc-1敲低的CKD小鼠的TA肌肉中MuRF-1的表達(dá)顯著降低。因此，抑制Atrolnc-1可防止CKD小鼠肌肉萎縮并抑制MuRF-1表達(dá)。

   我們目前的研究揭示了一種名為Atrolnc-1的lncRNA，并證明其與ABIN-1相互作用，促進(jìn)NF-κB的激活并導(dǎo)致肌肉中MuRF-1轉(zhuǎn)錄輸出的增加。抑制Atrolnc-1在萎縮肌肉中抑制MuRF-1表達(dá)并改善肌肉萎縮。我們的研究結(jié)果還為lncRNAs和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)之間的重要調(diào)節(jié)串?dāng)_提供了進(jìn)一步的證據(jù)，這些信號(hào)傳導(dǎo)可能具有超出肌肉疾病發(fā)病機(jī)理的更廣泛的相關(guān)性。

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