Self-Recognition of an Inducible Host lncRNA by RIG-I Feedback Restricts Innate Immune Response

通過RIG-I反饋誘導(dǎo)的宿主lncRNA的自我識別限制先天免疫反應(yīng)

期刊：CELL；影響因子：31.398                           

發(fā)表單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院                            

    自身RNA lnc-Lsm3b使用位于長莖結(jié)構(gòu)的不完全配對鏈上的初級富含GA的序列和結(jié)構(gòu)基序，結(jié)合RIG-1蛋白，從而有效地與非自身病毒RNA競爭，在先天反應(yīng)的后期螯合大部分RIG-I單體，從而防止下游抗病毒信號傳導(dǎo)過度活化并及時終止先天反應(yīng)以避免宿主組織損傷。

先天RNA傳感器RIG-I在識別“非自身”病毒RNA后，啟動抗病毒I型干擾素（IFN）生成中起著至關(guān)重要的作用。在這里，我們鑒定了宿主衍生的，IFN誘導(dǎo)型長非編碼RNA，lnc-Lsm3b，其可在RIG-I單體結(jié)合中與病毒RNA競爭，并且在先天反應(yīng)的晚期使RIG-I先天功能失活。從機制上講，lnc-Lsm3b的結(jié)合限制了RIG-I蛋白的構(gòu)象轉(zhuǎn)變并阻止了下游信號傳導(dǎo)，從而終止了I型IFN的產(chǎn)生。多元結(jié)構(gòu)基序和長莖結(jié)構(gòu)是lnc-Lsm3b對RIG-I結(jié)合和抑制的關(guān)鍵特征。

    先天免疫系統(tǒng)可以通過模式識別受體（PRR）感知入侵的病原體，以啟動有效的先天反應(yīng)來消除病原體。作為用于識別RNA病毒的最廣泛研究的PRR，視黃酸誘導(dǎo)基因-I（RIG-I）已被證明可識別細胞質(zhì)中的病毒RNA，并通過產(chǎn)生I型干擾素（IFN）和促炎細胞因子觸發(fā)先天免疫反應(yīng)。眾所周知，PRR觸發(fā)的I型IFN過量產(chǎn)生可能導(dǎo)致炎癥性自身免疫疾病。此外，觀察到作為干擾素刺激基因（ISG）之一的RIG-I可以通過I型IFN和其他先天性刺激和長期存在的因子顯著上調(diào)。因此必須精確調(diào)整相對持久的RIG-1的功能。然而，RIG-I激活先天細胞因子誘導(dǎo)的機制有效終止仍然是未知的。

    為了鑒定潛在的RIG-I相關(guān)宿主lncRNA，我們使用抗Flag抗體在小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞系中進行UV交聯(lián)和RNA免疫沉淀（UV-RIP）測定與RIG-I相互作用的lncRNA并構(gòu)建一個由靶向這些lncRNA的小干擾RNA（siRNA）組成的文庫。初步篩選表明，lncRNA NONMMUT057981可能參與RIG-I介導(dǎo)的抗病毒先天免疫反應(yīng)。

    來自UV-RIP-seq的覆蓋軌跡顯示RIG-I結(jié)合的RNA覆蓋部分NONMMUT057981序列（染色體6，NONCODE V4.0中的核苷酸91,516,046-91,517,771），包含Lsm3內(nèi)含子和外顯子的部分序列（圖1B）。通過在VSV感染后在RAW264.7細胞中使用抗RIG-I抗體獲得的RIP樣品的長讀PacBio SMRT測序驗證了lncRNA序列（圖1B）。有趣的是，通過5?和3?快速擴增cDNA末端和來自小鼠腹膜巨噬細胞的總RNA的PacBio長讀序列（GSE106254），我們發(fā)現(xiàn)了來自Lsm3基因座的兩個剪接轉(zhuǎn)錄物變體。變體1（稱為lnc-Lsm3a）（染色體6，核苷酸91,516,035-91,517,771，總計1,737nt）含有外顯子1，外顯子2，內(nèi)含子1和Lsm3基因的內(nèi)含子2的片段。與lnc-Lsm3a相比，可以結(jié)合RIG-1的變體2（稱為lnc-Lsm3b，總共768nt）缺乏內(nèi)含子1。用Stellaris FISH探針觀察到lnc-Lsm3b主要定位于細胞質(zhì)。此外，qPCR顯示lnc-Lsm3b的表達在RNA病毒感染或5?ppp-雙鏈RNA轉(zhuǎn)染后以時間依賴性方式顯著上調(diào)。

    qPCR證實si-lnc-Lsm3b顯著降低了lnc-Lsm3b的表達，但沒有改變Lsm3基因表達。敲除lnc-Lsm3b在用VSV或SeV感染而不是DNA病毒HSV-1感染時顯著增加巨噬細胞中I型IFN和促炎細胞因子白細胞介素IL-6的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)表明，內(nèi)源性lnc-Lsm3b可能在誘導(dǎo)I型IFN和促炎細胞因子中作為RIG-I活化的有效負調(diào)節(jié)因子。

    此外，我們產(chǎn)生了lnc-Lsm3b缺陷型（lnc-Lsm3b^-/-）RAW264.7細胞。當(dāng)病毒RNA感染細胞時，lnc -Lsm3b^-/-細胞比lnc-Lsm3b^+/+細胞產(chǎn)生更多的IFN-α和IFN-b，并且在病毒感染后12-20小時差異更明顯。此外，lnc-Lsm3b可以抑制病毒誘導(dǎo)的IFN-b和核因子kB（NF-κB）啟動子活性。相應(yīng)地，在感染后12或24小時，lnc-Lsm3b^-/-細胞中VSV的復(fù)制比lnc-Lsm3b^+/+細胞中的復(fù)制更顯著。我們進一步發(fā)現(xiàn)，VSV感染后16小時后lnc-Lsm3b^-/-細胞中IRF3（p-IRF3）和NF-kB信號傳導(dǎo)（p-p65和p-IKKa/b）的磷酸化水平顯著高于lnc-Lsm3b^+/+細胞。然而，lnc-Lsm3b對IRF3信號傳導(dǎo)的抑制作用比抑制NF-kB信號傳導(dǎo)更為顯著。這些數(shù)據(jù)表明，lnc-Lsm3b在抗病毒應(yīng)答后期有效抑制RIG-I觸發(fā)的I型IFN產(chǎn)生，不像其他負調(diào)節(jié)因子在抗病毒應(yīng)答早期抑制RIG-I觸發(fā)的信號傳導(dǎo)。

    我們通過尾靜脈注射高劑量VSV感染lnc-Lsm3b^-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)lnc-Lsm3b^-/-小鼠對VSV誘導(dǎo)的致死率的敏感性明顯低于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。當(dāng)用中等劑量的VSV注射時，lnc-Lsm3b^-/-小鼠在感染后18小時或24小時血清中產(chǎn)生的I型IFN（IFN-α和IFN-b）顯著高于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。與較高IFN的更有效的抗病毒作用一致，lnc-Lsm3b^-/-小鼠的病毒負荷顯著降低，因此，肺部炎癥的嚴重程度顯著降低。感染后，Ifn-a4和Ifn-b mRNA的水平在lnc-Lsm3b^-/-小鼠的組織中也顯著高于lnc-Lsm3b^+/+小鼠。值得注意的是，感染后lnc-Lsm3b的表達以時間依賴性方式在lnc-Lsm3b^+/+小鼠中增加，這與VSV感染后18小時和20小時IFNs表達的減少趨勢相反。

    我們首先確定了RIG-I與lnc-Lsm3b結(jié)合的區(qū)域。體外RNA pull-down測定顯示lnc-Lsm3b與RIG-1的CTD和解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合。然而，我們注意到分離的解旋酶結(jié)構(gòu)域是去除CARD和CTD結(jié)構(gòu)域的截短突變體（RIG-I 235-735），其保持在柔性開放構(gòu)象和暴露的多部分RNA結(jié)合位點。當(dāng)lnc-Lsm3b與RIG-I結(jié)合時，RIG-I處于自我抑制形式，并且解旋酶結(jié)構(gòu)域中的部分RNA結(jié)合位點被CARD的相互作用隱藏。為了進一步研究lnc-Lsm3b是否具有以自動抑制形式結(jié)合解旋酶結(jié)構(gòu)域的能力，我們在鉗形-CTD接頭中構(gòu)建C-末端截短以去除CTD結(jié)構(gòu)域（RIG-I 1-797，表示為deltaCTD），結(jié)果顯示lnc-Lsm3b不能與deltaCTD相互作用，表明當(dāng)RIG-I維持在無活性狀態(tài)時，lnc-Lsm3b剛剛與CTD結(jié)合但不與解旋酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合。RIP測定還證實了lnc-Lsm3b與RIG-1的CTD的結(jié)合。然后我們測量了lnc-Lsm3b和dsRNA與RIG-1的競爭性結(jié)合，發(fā)現(xiàn)RIG-I與poly（I：C）的結(jié)合隨著lnc-Lsm3b的量的增加而急劇下降。相反，lnc-Lsm3b與RIG-I的結(jié)合隨著5?ppp-dsRNA（圖4F）或從VSV感染的HEK293T細胞中提取的病毒RNA的增加而微弱地降低，表明lnc-Lsm3b具有競爭性地抑制5?ppp-dsRNA或病毒RNA與RIG-I結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)lnc-Lsm3b和5?ppp-dsRNA以競爭性方式結(jié)合RIG-1的CTD。

    我們在iCLIP文庫中分析了RIG-I的交聯(lián)誘導(dǎo)的截短位點。結(jié)果顯示RIG-1與lnc-Lsm3b強烈交聯(lián)，其中多數(shù)聚類在長莖結(jié)構(gòu)中，這通過RNA折疊預(yù)測。MEME算法在lnc-Lsm3b轉(zhuǎn)錄物的交聯(lián)位點周圍產(chǎn)生了富含GA的基序。相反，iCLIP文庫的iCLIP cDNA截短周圍沒有統(tǒng)計學(xué)上顯著的保守基序，表明其他RNA與RIG-I結(jié)合的模式與lnc-Lsm3b完全不同，因此，我們推測這些RNA可能在RIG-I功能中扮演其他角色。將lnc-Lsm3b的交聯(lián)簇中的每個富含GA的序列折疊成具有小凸起的小片段dsRNA，這與RIG-I與源自病毒基因組的polyU / UC或富含AU的RNA的優(yōu)選結(jié)合不同。為了測量不完全的堿基配對特征是否是富含GA的基序結(jié)合RIG-I必不可少的，我們用含有一個富含GA的基序的短RNA片段進行等溫滴定量熱法（ITC）（1,384-1,388 nt at lnc- Lsm3b折疊成典型的不完全堿基配對dsRNA（M1），具有5?-UUUUU-突出端，用于避免通過dsRNA結(jié)構(gòu)結(jié)合RIG-I。我們首先證明5?ppp-dsRNA可以高親和力與RIG-I結(jié)合，并且僅在ATP存在下以1：1的摩爾比形成復(fù)合物，與在ATP存在下dsRNA以相等摩爾比結(jié)合RIG-I的發(fā)現(xiàn)一致。引人注目的是，M1在沒有ATP的情況下與RIG-I結(jié)合，在ATP存在下具有比dsRNA更高的親和力，并且以1：1的摩爾比形成復(fù)合物。因此，我們得出結(jié)論，折疊成dsRNA區(qū)域內(nèi)的小凸起的主要基序是足以以高親和力結(jié)合RIG-1的最小元件。

    為了進一步探索lnc-Lsm3b抑制RIG-I活化的分子機制，我們在體外生物化學(xué)顯示，分離的CARDs可被RIG-I的解旋酶結(jié)構(gòu)域下拉，通過添加5?ppp-dsRNA（與CARD競爭結(jié)合解旋酶結(jié)構(gòu)域）消除CARDs-解旋酶相互作用。相反，lnc-Lsm3b在存在或不存在5?ppp-dsRNA時穩(wěn)定了CARD和解旋酶結(jié)構(gòu)域的相互作用，這在HEK293T細胞中通過CARD與RIG-1的deltaCARD（解旋酶和CTD）的共免疫沉淀證實。然而，一旦解旋酶結(jié)構(gòu)域中的保守界面殘基Phe540被丙氨酸（F540A）或天冬氨酸（F540D）氨基酸取代，CARD與突變體deltaCARD的結(jié)合就會被破壞，lnc-Lsm3b不再影響這兩個域之間的相互作用。因此觀察到CARD在沒有VSV感染的細胞中與deltaCARD共定位或在lnc-Lsm3b存在下與VSV感染共定位。這些結(jié)果共同顯示lnc-Lsm3b穩(wěn)定CARD和解旋酶結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用，在病毒感染時保持RIG-1蛋白的自身抑制構(gòu)象。

    我們進一步研究了自身lnc-Lsm3b在識別非自身病毒RNA后對細胞中RIG-I下游信號傳導(dǎo)的影響。lnc-Lsm3b的缺乏顯著增加了響應(yīng)VSV感染的RAW264.7細胞中RIG-1與TRIM25的相互作用。相應(yīng)地，在lnc-Lsm3b^-/-細胞中拯救lnc-Lsm3b表達擾亂了相互作用。此外，L929細胞中lnc-Lsm3b的過表達擾亂了TRIM25介導(dǎo)的病毒感染后RIG-1的K63連接的泛素化。lnc-Lsm3b缺陷增強了暴露于VSV感染的RAW264.7細胞中RIG-1與MAVS的相互作用。與對RIG-I活化沒有影響一致，lnc-Lsm3b-158和lnc-Lsm3b-435都不干擾RIG-I與MAVS的相互作用，這進一步證實了RIG-I活化的抑制需要lnc-Lsm3b的完整RNA第二結(jié)構(gòu)?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明自身lnc-Lsm3b是響應(yīng)RNA病毒感染的RIG-1信號傳導(dǎo)級聯(lián)的負調(diào)節(jié)物。

    我們揭示了通過lncRNA-RIG-I相互作用的RNA自我識別模型，其抑制RIG-I活化并以反饋方式防止I型IFN的過量產(chǎn)生以維持免疫穩(wěn)態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)拓寬了我們對lncRNA通過改變蛋白質(zhì)構(gòu)象調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性的作用機制的理解，并提供了一種潛在的策略來靶向先天ISG的下游信號傳導(dǎo)控制自身免疫性炎癥性疾病。

其他相關(guān)文獻解讀

文獻解讀：LncRNA FEZF1-AS1通過調(diào)節(jié)PKM2信號通路促進結(jié)直腸癌的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移

文獻解讀：TCGA甲基化數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)重要lncRNA

文獻解讀：LncRNA在調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化中的作用(IF:32.621)

文獻解讀：lncRNA三種調(diào)控機制

文獻解讀：胰腺β細胞中l(wèi)nc是如何發(fā)揮作用的？(IF:20.565)

文獻解讀：lnc-Blnc1與EDF1和LXR蛋白質(zhì)形成復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控作用

文獻解讀：lncRNA通過其衍生的miRNA調(diào)控腫瘤進展