LncRNA FEZF1-AS1 promotes tumor proliferation and metastasis in colorectal cancer by regulating PKM2 signaling

LncRNA FEZF1-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)PKM2信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌的腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移

期刊：CLIN CANCER RES；影響因子：10.199 

發(fā)表單位：江南大學(xué)附屬醫(yī)院

    FEZF1-AS1通過(guò)與丙酮酸激酶M2（PKM2）結(jié)合并增強(qiáng)STAT3信號(hào)傳導(dǎo)和有氧糖酵解，來(lái)促進(jìn)CRC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。

    我們使用lncRNA微陣列鑒定了CRC中一系列差異表達(dá)的lncRNA，并揭示FEZF1-AS1是過(guò)表達(dá)最多的之一。在兩個(gè)擴(kuò)展的CRC實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證證實(shí)了CRC中FEZF1-AS1的上調(diào)，并且顯示FEZF1-AS1表達(dá)增加與較差的存活率相關(guān)。功能測(cè)定顯示FEZF1-AS1促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。機(jī)制上，FEZF1-AS1可以結(jié)合并增加丙酮酸激酶2（PKM2）蛋白的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)和核PKM2水平增加。增加的細(xì)胞質(zhì)PKM2促進(jìn)丙酮酸激酶活性和乳酸產(chǎn)生（有氧糖酵解），而FEZF1-AS1誘導(dǎo)的核PKM2上調(diào)進(jìn)一步激活STAT3信號(hào)傳導(dǎo)。此外，PKM2在CRC組織中上調(diào)并與FEZF1-AS1表達(dá)和患者存活相關(guān)。

    結(jié)直腸癌（CRC）是全球第三大常見(jiàn)癌癥，其發(fā)病率和死亡率在中國(guó)都在增加。雖然已報(bào)道幾種lncRNA，例如UCA1，LINC00152和PVT1在CRC中異常表達(dá)并顯示出調(diào)節(jié)CRC腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，但大多數(shù)lncRNA在CRC中的功能和機(jī)制仍然未知。例如，CCAL可通過(guò)激活Wnt /β-連環(huán)蛋白通路促進(jìn)CRC進(jìn)展。我們之前的研究表明，UCA1和LINC00152通過(guò)促進(jìn)CRC的腫瘤生長(zhǎng)和化療耐藥而發(fā)揮癌基因的作用。在本研究中，我們使用lncRNA表達(dá)微陣列鑒定了一系列在CRC組織中具有異常表達(dá)的lncRNA。在兩個(gè)擴(kuò)增的CRC群組中的后續(xù)驗(yàn)證證實(shí)FEZF1反義RNA 1（FEZF1-AS1）（先前命名為AK057037或LOC154860）在超過(guò)60％的CRC組織中上調(diào)并且與較差的存活相關(guān)。

    在CRC細(xì)胞系中測(cè)量FEZF1-AS1的內(nèi)源性表達(dá)，并且選擇具有相對(duì)較高/較低FEZF1-AS1表達(dá)的HCT116/LoVo細(xì)胞用于隨后的功能測(cè)定，因?yàn)樗鼈兙哂邢鄬?duì)高的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和轉(zhuǎn)染效率。CCK-8和集落形成測(cè)定證明FEZF1-AS1敲低顯著抑制CRC細(xì)胞增殖和集落形成，而異位FEZF1-AS1表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成。此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，沉默FEZF1-AS1表達(dá)減少了S期細(xì)胞數(shù)量并增加了細(xì)胞凋亡，而異位FEZF1-AS1表達(dá)促進(jìn)了G1-S細(xì)胞周期進(jìn)展并抑制了CRC凋亡水平。此外，沉默FEZF1-AS1抑制CRC致瘤性，而FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)促進(jìn)小鼠的致瘤性?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)顯示了FEZF1-AS1在CRC中的生長(zhǎng)促進(jìn)功能。

    我們進(jìn)一步探討了FEZF1-AS1對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的影響。 Trans well測(cè)定顯示FEZF1-AS1敲低抑制HCT116和LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲，而FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)其遷移和侵襲。此外，我們使用兩個(gè)轉(zhuǎn)移模型，肺轉(zhuǎn)移小鼠模型和原位肝轉(zhuǎn)移小鼠模型評(píng)估了FEZF1-AS1對(duì)體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響。這些結(jié)果顯示FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)CRC肺和肝轉(zhuǎn)移。

    為了闡明FEZF1-AS1在CRC中的潛在分子機(jī)制，我們測(cè)量了FEZF1-AS1沉默的HCT116細(xì)胞中的基因表達(dá)譜。與對(duì)照細(xì)胞相比，分層聚類(lèi)揭示FEZF1-AS1沉默的HCT116細(xì)胞中1,261個(gè)基因的表達(dá)顯著改變（倍數(shù)變化> 1.5）。在改變的基因中，富集的基因（P <0.01）屬于幾種關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括JAK-STAT和HIF-1通路，已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。選擇這些通路中的幾個(gè)關(guān)鍵基因使用qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，并且結(jié)果證實(shí)了表達(dá)譜分析。這些數(shù)據(jù)表明FEZF1-AS1在CRC腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有廣泛的調(diào)節(jié)功能。為了進(jìn)一步鑒定由FEZF1-AS1直接調(diào)控的靶標(biāo)，我們使用RNA pull-down分析來(lái)下調(diào)FEZF1-AS1結(jié)合蛋白。將回收的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并選擇幾個(gè)額外的差異條帶用于質(zhì)譜分析。基于通過(guò)質(zhì)譜分析預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的功能注釋和由FEZF1-AS1調(diào)節(jié)的潛在通路發(fā)現(xiàn)PKM2，其可以通過(guò)充當(dāng)?shù)鞍准っ讣せ?/span>STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，被認(rèn)為是FEZF1-AS1相關(guān)蛋白。Western印跡進(jìn)一步證實(shí)了在RNA pull-down測(cè)定中使用回收的蛋白質(zhì)將FEZF1-AS1與PKM2結(jié)合。用抗PKM2抗體進(jìn)行的RIP測(cè)定也證明了PKM2和FEZF1-AS1之間的關(guān)聯(lián)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明FEZF1-AS1與PKM2物理結(jié)合。

    為了確定FEZF1-AS1是否調(diào)節(jié)PKM2活性，我們首先通過(guò)如前所述的qRT-PCR研究了FEZF1-AS1的亞細(xì)胞定位。FEZF1-AS1定位于HCT116細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明其在CRC中的復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制?？紤]到這一點(diǎn)，我們測(cè)量了PKM2在FEZF1-AS1耗盡的或FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)的CRC細(xì)胞中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。與其相應(yīng)對(duì)照中的那些相比，在FEZF1-AS1耗盡的HCT116細(xì)胞或FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)的LoVo細(xì)胞中未觀察到PKM2的mRNA水平的顯著變化。然而，在FEZF1-AS1沉默的HCT116細(xì)胞中，總PKM2和核PKM2水平均顯著下降，而在FEZF1-AS1中過(guò)表達(dá)LoVo細(xì)胞則增加，表明FEZF1-AS1可以在轉(zhuǎn)錄后水平增加PKM2蛋白水平。此外，我們觀察到抑制蛋白酶體活性阻止了si-FEZF1-AS1誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞中內(nèi)源性PKM2下調(diào)，表明通過(guò)泛素-蛋白酶體通路的PKM2降解被FEZF1-AS1抑制。

    為了研究FEZF1-AS1是否通過(guò)調(diào)節(jié)PKM2在CRC中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)功能，我們首先檢測(cè)了PKM2對(duì)FEZF1-AS1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的影響，并觀察到PKM2過(guò)表達(dá)可以模擬FEZF1-AS1的腫瘤促進(jìn)作用，而PKM2敲低阻斷了CRC細(xì)胞中FEZF1-AS1誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。此外，PKM2敲低逆轉(zhuǎn)了FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)CRC細(xì)胞中增加的細(xì)胞遷移率，并且PKM2過(guò)表達(dá)部分恢復(fù)了FEZF1-AS1沉默的CRC細(xì)胞中降低的細(xì)胞遷移率。然后，我們使用FEZF1-AS1Δ600突變體和缺乏A2結(jié)構(gòu)域的PKM2突變體（PKM2ΔA2）評(píng)估可能區(qū)域的功能重要性，這些區(qū)域解釋了CRC細(xì)胞中FEZF1-AS1和PKM2之間的結(jié)合。FEZF1-AS1突變體不能恢復(fù)CRC細(xì)胞中PKM2敲低抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)，并且PKM2突變體不能挽救FEZF1-AS1耗盡的CRC細(xì)胞中的細(xì)胞生長(zhǎng)，表明FEZF1-AS1的1,200-1,800區(qū)域和PKM2的A2區(qū)域?qū)ζ渲掳┳饔弥陵P(guān)重要。總之，這些數(shù)據(jù)證明FEZF1-AS1至少部分地通過(guò)結(jié)合和促進(jìn)PKM2活性在CRC中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)功能。

    為了進(jìn)一步確定CRC組織中FEZF1-AS1和PKM2之間的相關(guān)性，我們首先使用IHC評(píng)估了138對(duì)CRC和NCT樣品中PKM2的蛋白質(zhì)表達(dá)。IHC染色結(jié)果顯示，與其配對(duì)的NCT相比，超過(guò)一半的CRC（55.1％，76/138）顯示PKM2表達(dá)增加。CRC組織中的PKM2蛋白水平與FEZF1-AS1水平正相關(guān)（r = 0.382，P <0.001），證實(shí)了FEZF1-AS1在臨床CRC組織中對(duì)PKM2的正調(diào)節(jié)。同時(shí)，在裸鼠的CRC異種移植物中也觀察到FEZF1-AS1和PKM2水平之間的正相關(guān)。

    在過(guò)表達(dá)CRC細(xì)胞的FEZF1-AS1中，核PKM2顯著增加，并且表達(dá)譜分析顯示STAT3通路可能被FEZF1-AS1調(diào)節(jié)，表明FEZF1-AS1的腫瘤促進(jìn)功能主要由PKM2的蛋白激酶活性介導(dǎo)。為了確定FEZF1-AS1是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)核PKM2活性激活STAT3信號(hào)，我們使用熒光素酶測(cè)定評(píng)估了具有不同FEZF1-AS1和PKM2表達(dá)水平的CRC細(xì)胞中STAT3通路的狀態(tài)。在過(guò)表達(dá)CRC細(xì)胞的FEZF1-AS1或PKM2中激活STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，并且沉默PKM2表達(dá)阻斷了FEZF1-AS1誘導(dǎo)的STAT3激活。相反，FEZF1-AS1敲低抑制STAT3活化，其通過(guò)PKM2過(guò)表達(dá)拯救。Western印跡結(jié)果進(jìn)一步顯示異位FEZF1-AS1表達(dá)增加STAT3（Tyr705）的磷酸化，其被PKM2敲低阻斷。相反，FEZF1-AS1敲低抑制STAT3磷酸化，其通過(guò)PKM2的過(guò)表達(dá)而挽救。與這些結(jié)果一致，STAT3通路的下游靶標(biāo)（MCL1，BIRC5，CCND1，BCL2L1，CDH1，MMP2和MMP9）在FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)的CRC細(xì)胞中也顯著上調(diào)，并且它們的表達(dá)被PKM2敲低部分抑制?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明FEZF1-AS1通過(guò)PKM2激活STAT3通路。

    PKM2四聚體是細(xì)胞質(zhì)中PKM2的活性形式，具有高丙酮酸激酶活性，這是有氧糖酵解的限速因子。細(xì)胞質(zhì)PKM2也受FEZF1-AS1調(diào)節(jié)，表明FEZF1-AS1也可調(diào)節(jié)有氧糖酵解。為了證明這一點(diǎn)，我們分析了FEZF1-AS1是否影響PKM2的丙酮酸激酶活性。FEZF1-AS1過(guò)表達(dá)增加丙酮酸激酶活性和乳酸產(chǎn)生，其在CRC細(xì)胞中PKM2敲低顯著受損。相比之下，FEZF1-AS1敲低抑制了CRC細(xì)胞中丙酮酸激酶活性和乳酸產(chǎn)生，其通過(guò)PKM2過(guò)表達(dá)拯救。FEZF1-AS1Δ600突變體未能像全長(zhǎng)FEZF1-AS1那樣增加丙酮酸激酶活性和乳酸產(chǎn)生。PKM2ΔA2突變體也不能介導(dǎo)FEZF1-AS1對(duì)丙酮酸激酶活性和乳酸產(chǎn)生的影響?？傊@些數(shù)據(jù)表明，除了其對(duì)PKM2蛋白激酶活性的主要調(diào)節(jié)作用外，FEZF1-AS1還可通過(guò)增加PKM2的丙酮酸激酶活性來(lái)促進(jìn)有氧糖酵解。

    FEZF1-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)PKM2 / STAT3信號(hào)傳導(dǎo)和糖酵解來(lái)增加CRC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，提供了CRC中FEZF1-AS1 / PKM2網(wǎng)絡(luò)的第一個(gè)證據(jù)。這些數(shù)據(jù)表明FEZF1-AS1 / PKM2信號(hào)傳導(dǎo)可能是CRC治療中有希望的治療靶點(diǎn)。然而，應(yīng)進(jìn)一步研究以確定介導(dǎo)FEZF1-AS1和PKM2之間關(guān)聯(lián)的精確位點(diǎn)，這是開(kāi)發(fā)靶向FEZF1-AS1/PKM2信號(hào)傳導(dǎo)的特異性抑制劑的關(guān)鍵。

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