lncRNA Epigenetic Landscape Analysis Identifies EPIC1 as an Oncogenic lncRNA that Interacts with MYC and Promotes Cell-Cycle Progression in Cancer

lncRNA表觀遺傳分析將EPIC1鑒定為與MYC相互作用并促進(jìn)癌細(xì)胞周期進(jìn)程的致癌lncRNA

期刊：Cancer Cell；影響因子：22.844              

發(fā)表單位：匹茲堡大學(xué)   

    TCGA lncRNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化數(shù)據(jù)分析尋找重要的lncRNA，發(fā)現(xiàn)EPIC1作為潛在的致癌lncRNA，通過其129-283nt區(qū)域與MYC蛋白相互作用從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)揮作用。

    我們描述了編碼長鏈非編碼RNA（lncRNA）的基因的表觀遺傳景觀，涉及6,475個(gè)腫瘤和455個(gè)癌細(xì)胞系。與癌癥中的CpG島高甲基化表型形成鮮明對(duì)比，我們觀察到癌癥中1,006個(gè)lncRNA基因的復(fù)發(fā)低甲基化，包括EPIC1（表觀遺傳學(xué)誘導(dǎo)的lncRNA1）。EPIC1的過度表達(dá)與管腔B乳腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，并在體外和體內(nèi)增強(qiáng)腫瘤生長。從機(jī)制上講，EPIC1通過EPIC1的129-283區(qū)域與MYC相互作用促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。EPIC1敲低降低了MYC對(duì)其靶基因（例如，CDKN1A，CCNA2，CDC20和CDC45）的占據(jù)。MYC消耗在體外和體內(nèi)消除了EPIC1對(duì)MYC靶標(biāo)和管腔乳腺癌腫瘤發(fā)生的調(diào)節(jié)。

    最近對(duì)人類癌癥轉(zhuǎn)錄組的全基因組表征已經(jīng)證明lncRNA表達(dá)是癌癥中最普遍的轉(zhuǎn)錄變化之一。表觀遺傳調(diào)節(jié)是用于控制lncRNA表達(dá)和組織特異性的主要機(jī)制之一。表觀遺傳改變已被確定為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志之一。然而，lncRNA基因的表觀遺傳改變及其在癌癥中的后果仍未得到很好的表征?；蚪M規(guī)模研究已經(jīng)對(duì)腫瘤中的DNA甲基化變化產(chǎn)生了重要的見解，但主要集中在PCG啟動(dòng)子上。在癌癥中表征lncRNA表觀遺傳景觀的努力已經(jīng)在lncRNA的不完整注釋和缺乏能夠檢測(cè)癌癥中lncRNA表觀遺傳和表達(dá)改變的平臺(tái)的限制下進(jìn)行。大規(guī)模癌癥基因組/表觀遺傳項(xiàng)目的出現(xiàn)，如癌癥基因組圖譜（TCGA）研究網(wǎng)絡(luò)項(xiàng)目，為表征癌癥中lncRNA表觀遺傳景觀提供了極好的機(jī)會(huì)。

    為了研究癌癥中的lncRNA DNA甲基化，我們開發(fā)了一種計(jì)算方法，將HM450探針重新用于lncRNA啟動(dòng)子。我們首先通過使用TCGA Pan-Cancer數(shù)據(jù)庫（syn4382671，表S1）比較腫瘤和正常組織之間的lncRNA啟動(dòng)子的DNA甲基化譜來確定癌癥中的lncRNA DNA甲基化模式。我們?cè)谌橄侔┙M織中觀察到高甲基化和低甲基化的lncRNA啟動(dòng)子。該觀察結(jié)果與PCG啟動(dòng)子形成鮮明對(duì)比，PCG啟動(dòng)子主要在乳腺癌中高度甲基化。在不與PCG共享啟動(dòng)子的基因間lncRNA中，有504個(gè)基因間lncRNA啟動(dòng)子顯示顯著的低甲基化，639個(gè)基因間lncRNA啟動(dòng)子顯示乳腺癌中顯著的高甲基化（錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率[FDR] <0.05且效應(yīng)大小> 0.2）。lncRNA啟動(dòng)子的低甲基化模式在另外九種也具有匹配的正常組織的癌癥類型中一致地觀察到。

    為了確定lncRNA的表達(dá)是否受其啟動(dòng)子DNA甲基化變化的調(diào)節(jié)（例如，低甲基化導(dǎo)致過表達(dá)），我們整合了來自MiTranscriptome的lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括5,602個(gè)TCGA樣品。我們的分析側(cè)重于20種具有DNA甲基化和lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的癌癥類型的TCGA樣本。我們應(yīng)用啟發(fā)式策略來鑒定腫瘤中表觀遺傳活化（EA）或表觀遺傳學(xué)沉默（ES）的lncRNA與正常組織中的DNA甲基化狀態(tài)相比較。以20個(gè)癌癥類型為特征的患者為中心的基質(zhì)具有2,123個(gè)lncRNA基因的DNA甲基化狀態(tài)，包括1,006個(gè)EA和1,117個(gè)ES lncRNA，其在至少一種癌癥類型中顯示出表觀遺傳改變。所有表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)的lncRNA，在腫瘤中具有低甲基化或高甲基化，在它們的表達(dá)和啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài)之間顯示出顯著的負(fù)相關(guān)（FDR <0.01）。

    我們接下來分析了lncRNA表觀遺傳狀態(tài)與20種癌癥類型患者存活率的關(guān)系。前20種EA lncRNA中的12種與至少1種癌癥類型中的不良存活顯著相關(guān)，而前20種ES lncRNA中的10種與有利存活顯著相關(guān)。在這些存活相關(guān)的lncRNA中有SNHG12和MINCR，它們?cè)诙喾N癌癥類型中表觀遺傳活化，包括乳腺癌，膀胱癌，子宮內(nèi)膜癌，結(jié)腸直腸癌和肺癌。為了探索lncRNA表觀遺傳改變與已知腫瘤基因的體細(xì)胞改變之間的關(guān)系，我們將lncRNA表觀遺傳改變與同一腫瘤中已知蛋白編碼癌基因的突變和拷貝數(shù)改變結(jié)合起來。值得注意的是，表觀遺傳學(xué)調(diào)控的lncRNA與一組癌癥基因突變和拷貝數(shù)改變顯示出強(qiáng)烈共存。例如，EA lncRNA在多種癌癥類型中的TP53突變腫瘤中顯著富集。相比之下，ES lncRNA與EGFR擴(kuò)增和突變表現(xiàn)出顯著的互斥性。

    在多種癌癥類型中最常表觀遺傳激活的lncRNA是ENSG00000224271（表觀遺傳誘導(dǎo)的lncRNA1 [EPIC1]）。該lncRNA在包括乳腺癌在內(nèi)的十種癌癥類型中高達(dá)90％的腫瘤樣品中表觀遺傳激活。我們的算法確定HM450中的三個(gè)探針映射到EPIC1 CpG島（圖A）。基于三種探針的β值，通過534個(gè)乳腺腫瘤中的層次聚類分析鑒定了三個(gè)乳腺癌亞組（圖B）。高甲基化亞組包括196（36.7％）個(gè)乳腺腫瘤，并且表現(xiàn)出與正常乳腺組織中相似的高EPIC1甲基化水平（圖B）。該亞組的乳腺腫瘤的特征在于EPIC1表達(dá)降低（圖C和D），并且與其他兩組相比具有較高的總存活率（圖E）。相反，腫瘤表現(xiàn)出EPIC1低甲基化和EPIC1表達(dá)增加的患者存活率最低（圖C-E）。為了確定EPIC1表達(dá)是否與乳腺癌中較差的患者存活率強(qiáng)烈相關(guān)，我們將探針從五個(gè)Affymetrix微陣列重新注釋為lncRNA，并在特異性檢測(cè)EPIC1表達(dá)的Affymetrix HG-U133plus2微陣列中鑒定出一個(gè)探針（1563009_at）。如圖F所示，EPIC1的表達(dá)增加始終與6個(gè)獨(dú)立的患者群體（包括905個(gè)乳腺腫瘤）中的不良存活相關(guān)（圖F）。

    為了評(píng)估EPIC1在癌癥中的致癌作用，我們使用qRT-PCR分析了8種癌癥類型中28種細(xì)胞系中的EPIC1表達(dá)狀態(tài)。與EPIC1在管腔B乳腺癌亞型中的活化一致，EPIC1在管腔乳腺癌細(xì)胞系（例如，BT-474，MB361，MCF-7，ZR-75-1和T-47D）以及卵巢癌（A2780cis和OVCAR-4），胰腺癌（BxPC-3和PANC-1），前列腺癌（PC-3）和白血?。?/span>K562）細(xì)胞系中過表達(dá)。我們使用來自MCF-7和T-47D細(xì)胞的總RNA進(jìn)一步進(jìn)行5'-RACE和3'-RACE克隆以鑒定功能性EPIC1同種型?？寺×?/span>EPIC1的三種剪接變體，包括同種型v1（567nt），同種型v2（844nt）和同種型v3（882nt）。EPIC1敲低導(dǎo)致在管腔乳腺癌細(xì)胞MCF-7和ZR-75-1中以時(shí)間依賴性方式降低細(xì)胞增殖。軟瓊脂測(cè)定進(jìn)一步證明EPIC1敲低顯著抑制癌細(xì)胞的貼壁依賴性生長。此外，細(xì)胞周期分析顯示EPIC1的沉默導(dǎo)致MCF-7和ZR-75-1細(xì)胞中的G0/G1停滯。接下來，我們使用慢病毒shRNA建立穩(wěn)定的EPIC1敲低細(xì)胞。與shCtrl細(xì)胞相比，兩種shEPIC1穩(wěn)定細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞增殖，不依賴貼壁的生長和體內(nèi)異種移植物生長。

    細(xì)胞組分PCR和亞細(xì)胞RNA-seq分析顯示EPIC1 RNA主要位于細(xì)胞核中，表明EPIC1可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和染色質(zhì)相互作用中起作用。為了探索這種可能性，對(duì)單獨(dú)或合并靶向EPIC1的兩種siRNA轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析。MCF-7細(xì)胞中的EPIC1敲低導(dǎo)致805個(gè)基因的調(diào)節(jié)（317個(gè)基因的上調(diào)和488個(gè)基因的下調(diào)），這些基因與2,005個(gè)EPIC1相關(guān)基因高度重疊，這些基因與559個(gè)TCGA乳腺腫瘤中的EPIC1表達(dá)顯著相關(guān)（p = 2.6×10^-25）?；蚣患治觯?/span>GSEA）分析顯示，20種癌癥類型中有17種在EPIC1相關(guān)基因中顯著富集了細(xì)胞周期相關(guān)的生物過程，如“MYC靶標(biāo)”，“G2M檢查點(diǎn)”和“E2F靶標(biāo)”。在MCF-7細(xì)胞中EPIC1調(diào)節(jié)的基因中富集相同的細(xì)胞過程。其中，MYC通路/靶標(biāo)中很多基因被EPIC1調(diào)節(jié)。例如，MYC靶向CDC45，CDC20和CCNA2被EPIC1敲低顯著下調(diào)。此外，在EPIC1敲低后顯著誘導(dǎo)CDKN1A（編碼p21蛋白）。p21是在G1和S期細(xì)胞周期進(jìn)展的公認(rèn)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其被MYC直接抑制。與我們的觀察結(jié)果一致，即EPIC1敲低導(dǎo)致癌細(xì)胞在G0/G1期停滯。

    RNA pull-down測(cè)定顯示MYC蛋白可以通過體外轉(zhuǎn)錄的生物素化的EPIC1有義轉(zhuǎn)錄物共沉淀，但不能通過EPIC1反義轉(zhuǎn)錄物共沉淀。為了繪制對(duì)應(yīng)于MYC結(jié)合的EPIC1功能基序，我們使用一系列截短的EPIC1片段進(jìn)行了體外RNA pull-down測(cè)定。該分析顯示EPIC1的核苷酸1-358（EPIC11-358nt）足以與MYC蛋白相互作用，而其他EPIC1截短的片段不能。為了更精確地繪制與MYC結(jié)合的EPIC1序列，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了EPIC1 1-358 nt區(qū)域的7個(gè)截短或缺失突變體，并揭示了3個(gè)缺失突變體（Δ121-180nt，Δ181-240nt和Δ241- 300 nt）可以消除EPIC1與MYC蛋白的結(jié)合。所有三個(gè)區(qū)域（129-283nt）的缺失也消除了EPIC1與MYC蛋白的相互作用（命名為ΔMYC-EPIC1）。這些數(shù)據(jù)表明EPIC1 129-283 nt區(qū)域是EPIC1與MYC蛋白結(jié)合所必需的。刪除MYC蛋白的148-220aa區(qū)域（命名為ΔEPIC1-MYC）消除了其與EPIC1的相互作用。總的來說，我們的研究結(jié)果表明，EPIC1通過129-283核苷酸序列與MYC的148-220 aa區(qū)域相互作用。

    觀察到EPIC1直接與MYC相互作用，我們進(jìn)一步分析了EPIC1對(duì)MCF-7細(xì)胞中MYC靶基因報(bào)道分子（例如p21和CCNA2啟動(dòng)子）的影響。報(bào)道分析顯示，EPIC1或MYC的敲低顯著調(diào)節(jié)p21-Luc和CCNA2-Luc報(bào)道熒光素酶活性（圖7A）。我們對(duì)MYC染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）數(shù)據(jù)和EPIC1敲低MCF-7細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析。在805個(gè)EPIC1調(diào)節(jié)的基因中，785個(gè)在MCF-7 ChIP-seq數(shù)據(jù)的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)中在其啟動(dòng)子上具有強(qiáng)大的MYC占據(jù)。進(jìn)行ChIP-qPCR并驗(yàn)證EPIC1敲低顯著降低MYC在26個(gè)靶標(biāo)的啟動(dòng)子上的占據(jù)，包括CDKN1A（p21），CCNA2，CDC20和CDC45。已知MYC與DNA結(jié)合并通過與另一種轉(zhuǎn)錄因子MAX的異二聚化作為轉(zhuǎn)錄因子起作用。MCF-7細(xì)胞中的MYC和MAX Co-IP測(cè)定顯示EPIC1敲低可以適度地減少M(fèi)YC-MAX復(fù)合物的形成。此外，EPIC1的過表達(dá)，而不是ΔMYC-EPIC1，可以增強(qiáng)由MYC和MAX介導(dǎo)的報(bào)道熒光素酶活性。這些結(jié)果表明EPIC1通過其129-283nt序列（即MYC結(jié)合序列）促進(jìn)MYC對(duì)EPIC1調(diào)節(jié)基因的占據(jù)。

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