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Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA
Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA
通過長鏈非編碼RNA轉錄調節(jié)巨噬細胞膽固醇流出和動脈粥樣硬化形成
期刊：Nature Medicine ；影響因子：32.621
發(fā)表單位：加利福尼亞大學
導 讀
LncRNA在調節(jié)動脈粥樣硬化中的作用，MeXis與轉錄共激活因子DDX17的啟動子結合相互作用促進關鍵膽固醇外排基因Abca1的表達。
摘 要
核受體調節(jié)基因表達以響應環(huán)境因素，但控制核受體細胞類型特異性的分子事件仍然知之甚少。在這里，我們概述了非編碼RNA在調節(jié)LXRs的細胞類型特異性作用中的作用。我們將lncRNA MeXis鑒定為關鍵膽固醇外排基因Abca1的LXR依賴性轉錄的放大器。缺乏MeXis基因的小鼠以組織選擇性方式顯示減少的Abca1表達。此外，小鼠骨髓細胞中MeXis的缺失改變了Abca1基因座的染色體結構，損害了細胞對膽固醇的反應，并加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。機理研究表明，MeXis與轉錄共激活因子DDX17的啟動子結合相互作用并引導其結合。
研究背景
巨噬細胞在動脈壁內積聚過量膽固醇是動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的關鍵步驟。因此，巨噬細胞響應環(huán)境因素和脂質過量而整合代謝和免疫信號傳導的能力是疾病易感性的重要決定因素。LXR是配體依賴性轉錄因子，其調節(jié)參與巨噬細胞對膽固醇反應的基因的表達，并且還調節(jié)炎癥信號傳導。LXR的激活通過誘導包括Abca1的基因干細胞促進反向膽固醇轉運，Abca1編碼質膜轉運蛋白ABCA1。這種ATP依賴性轉運蛋白對于HDL的產生至關重要，其功能在Tangier病中受損，這是一種以HDL缺乏和加速動脈粥樣硬化為特征的綜合征。
結 果
1
調節(jié)巨噬細胞lncRNAs對膽固醇負荷的反應
LXR以特定情境的方式影響與脂質代謝相關的大量基因的表達。我們注意到，與其他細胞類型如肝細胞和脂肪細胞相比，編碼關鍵膽固醇外排介質ABCA1的基因在巨噬細胞中被LXR更高水平的誘導（補充圖1a）。為了深入了解這種細胞類型選擇性LXR反應的基礎，我們對用或不用LXR激動劑GW3965處理的小鼠腹膜巨噬細胞進行了全基因組轉錄分析。正如預期的那樣，LXR激動劑治療強烈誘導了經典蛋白質編碼LXR靶基因的表達（補充圖1b）。與LXR在代謝中確定的作用一致，GW3965誘導基因的本體術語網(wǎng)絡顯示出對脂質調節(jié)過程和巨噬細胞特異性通路的強烈富集（補充圖1c）。有趣的是，我們還觀察到LXR活化誘導了有限數(shù)量的lncRNA（補充圖1d）。這些lncRNA中的一些位于蛋白質編碼基因的鄰近基因組區(qū)域中，在介導LXR對代謝的作用中具有確定的作用。與這些lncRNA最接近的蛋白質編碼基因的基因本體分析顯示膽固醇代謝過程的富集，這與這些非編碼RNA的子集可調節(jié)相鄰蛋白質編碼基因的活性的想法一致。（注意：作者通過RNAseq驗證LXR激動劑誘導LXR靶基因的表達，并找到差異表達的lncRNA）。
通過LXR ChIP-seq研究也顯示LXR與其基因調節(jié)區(qū)域結合的證據(jù)的最強烈誘導的命中之一是預測的轉錄物，注釋為AI427809。我們將該轉錄物命名為MeXis（巨噬細胞表達的LXR誘導的序列）（注意：ChIP-seq結合啟動子尋找臨近lncRNA，用于研究）。值得注意的是，MeXis基因位于已建立的LXR靶基因Abca1和LeXis附近。RNA拷貝數(shù)分析顯示MeXis在小鼠巨噬細胞中高表達，實時PCR分析顯示，LXR（GW3965）和RXR（LG268）激動劑在原代巨噬細胞中以LXR依賴性方式誘導MeXis和Abca1表達。
2
MeXis是一種影響Abca1表達的LXR反應性lncRNA
我們鑒定了MeXis啟動子區(qū)域內的LXR反應元件（LXRE），其在ChIP-seq分析中被LXR結合。
區(qū)分蛋白質編碼和非編碼RNA的計算分數(shù)預測了MeXis轉錄本的低編碼潛力。小鼠骨髓衍生的巨噬細胞中的單分子RNA FISH證實了MeXis的核定位。MeXis主要位于富含染色質的不溶性核沉淀中。即使在高水平外源表達時，MeXis主要是核。這種定位強烈表明MeXis最有可能充當核RNA，而不是在細胞質中被翻譯成短蛋白。
由于已經顯示一些lncRNA調節(jié)相鄰基因的表達（注意：lncRNA的cis調控機制），我們假設MeXis的喪失可能影響Abca1的表達。為了支持這一想法，siRNA介導的小鼠腹腔巨噬細胞中MeXis或RXRα/β的敲低降低了Abca1轉錄水平。靶向MeXis的反義寡核苷酸（ASO）也降低Abca1水平。相反，巨噬細胞中MeXis的穩(wěn)定過表達增強了ApoA-I受體的Abca1表達和膽固醇外流能力。
3
MeXis的缺乏影響Abca1表達，膽固醇流出和動脈粥樣硬化形成
為了更好地破譯MeXis對巨噬細胞代謝的貢獻，我們產生了MeXis敲除小鼠。與我們的siRNA研究一致，MeXis-/-腹膜巨噬細胞顯示Abca1轉錄水平降低。值得注意的是，在西方飲食喂養(yǎng)的小鼠中，與WT小鼠相比，在MeXis-/-組織中Abca1 mRNA表達差異地改變。我們還證實，與WT巨噬細胞相比，MeXis中的Abca1蛋白水平降低。這些結果表明MeXis以特定于上下文的方式增強Abca1表達。
我們觀察到響應MeXis過表達，敲低或敲除的其他LXR靶基因變化，表明MeXis不等同地調節(jié)所有LXR靶基因。WT和MeXis-/-原代腹膜巨噬細胞的無偏倚轉錄組學分析顯示脂質代謝通路和炎癥信號傳導的富集與MeXis-/-巨噬細胞中Abca1表達的改變一致，我們觀察到與來自WT小鼠的MeXis-/-的腹膜巨噬細胞中ApoA-I依賴性外排能力的降低?？傊?，這些結果表明，在面對巨噬細胞膽固醇負荷時，MeXis是最大Abca1表達所必需的。
為了進一步探索MeXis作為RNA的能力并確認其在體內調節(jié)Abca1表達的能力，我們使用腺病毒載體在小鼠肝臟中表達MeXis。值得注意的是，我們觀察到血清膽固醇水平的增加-肝臟ABCA1表達增強的標志性特征-在肝臟中異位表達MeXis的小鼠中。我們還證實了MeXis在肝臟中的表達誘導Abca1 mRNA而不影響其他LXR靶基因的表達。MeXis表達相應地增加ABCA1蛋白水平。
4
MeXis與DDX17相互作用并調節(jié)Abca1轉錄
eRNA表達可以作為增強子位點活性和轉錄激活的替代標志物。先前已經定義了巨噬細胞中Abca1周圍的增強子元件。有趣的是，與WT細胞相比，MeXis-/-巨噬細胞顯示響應于LXR活化的Abca1增強子的eRNA表達降低。為了評估MeXis是否可以影響反式Abca1基因的轉錄，我們用雜合的MeXis-/+小鼠雜交Abca1Flox/Flox小鼠。這種策略使我們能夠特異性地測量MeXis缺陷對轉化為突變MeXis等位基因的Abca1轉錄物的影響。我們發(fā)現(xiàn)MeXis表達的減少降低了反式Abca1的表達。
這些觀察結果使我們假設MeXis可能影響Abca1基因座的染色質動力學，從而調節(jié)其轉錄。與此觀點一致，在腹膜巨噬細胞上進行的ATAC-seq在MeXis缺陷的情況下顯示在Abca1基因座內的多個位點處的鈍化可及性。對Abca1啟動子附近可及位點的定量顯示MeXis-/-巨噬細胞的可及性降低。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)Tlr4基因座的可及性沒有差異，表明MeXis缺陷對某些染色質區(qū)域的選擇性。
為了進一步研究MeXis作用的機制，我們使用無偏的lncRNA：染色質親和捕獲技術從巨噬細胞提取物中提取MeXis并鑒定相互作用的蛋白質（注意：RNA pull down尋找其直接結合的蛋白）。通過質譜分析MeXis相互作用鑒定出DDX17，一種已建立的核受體輔激活因子，作為潛在的相互作用配偶。我們證實了MeXis和DDX17在小鼠巨噬細胞的RNA免疫沉淀研究中的強烈相互作用，無論是否使用交聯(lián)劑。DDX17作為轉錄共激活因子的先前表征使我們假設DDX17可以在Abca1基因座處起作用。根據(jù)這一想法，ChIP-PCR分析顯示DDX17在巨噬細胞中Abca1增強子區(qū)域的LXR結合位點富集。此外，由于MeXis缺失，DDX17結合顯著降低。有趣的是，LXR結合的模式也由于MeXis的喪失而改變，Abca1啟動子的占據(jù)減少，但在內含子位點的結合增強。這些結果表明MeXis促進DDX17的共激活因子作用以增強LXR介導的Abca1表達。為了明確確定MeXis是否被募集到Abca1基因座，我們使用ChIRP-qPCR技術，發(fā)現(xiàn)MeXis在Abca1的許多位點結合，顯示MeXis-/-和WT巨噬細胞之間的差異可及性。
為了進一步確定DDX17在Abca1調節(jié)中的重要性，我們利用CRISPR-Cas編輯產生了DDX17缺陷的永生化骨髓衍生的巨噬細胞。使用兩種不同的切除策略刪除DDX17降低了基線時的Abca1水平并響應LXR激活。這些結果強烈表明DDX17是巨噬細胞中Abca1表達所必需的（注意：敲低lnc的結合蛋白查看是否影響潛在靶基因Abca1的表達）。為了分析DDX17和MeXis之間的上位關系，我們使用CRISPR-Cas生成DDX17/MeXis雙敲除巨噬細胞。與DDX17單敲除相比，在DDX17缺陷的情況下缺失MeXis未能進一步降低Abca1轉錄物或蛋白質水平?？傊?，這些結果證明DDX17有助于依賴于Mexis的Abca1調節(jié)。
討 論
該研究還揭示了lncRNA在心血管疾病中的意外作用。通過LXR通路控制巨噬細胞基因表達與動脈粥樣硬化的發(fā)病機理有因果關系。MeXis的鑒定填補了我們對控制細胞對膽固醇超負荷和動脈粥樣硬化的反應的通路的理解中的空白。很有可能推測靶向LXR-MeXis-Abca1軸可以增強巨噬細胞逆向膽固醇轉運以治療或預防動脈粥樣硬化疾病，同時繞過不希望的LXR激活在其他組織中的副作用。
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