Human Pancreatic β Cell lncRNAs Control Cell-Specific Regulatory Networks

人胰腺β細胞lncRNAs控制細胞特異性調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

期刊：Cell?Metabolism；影響因子：20.565    

發(fā)表單位：倫敦帝國理工學(xué)院 

    胰腺β細胞中l(wèi)nc是如何發(fā)揮作用的？作者發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA與敲低轉(zhuǎn)錄因子對基因表達的影響類似，提示lncRNA在調(diào)控中的重要作用。依據(jù)lnc順式調(diào)控機制，在重要轉(zhuǎn)錄因子PDX1附近，找到lncRNA PLUTO，發(fā)現(xiàn)該lnc調(diào)控PDX1的表達。

最近的研究發(fā)現(xiàn)人類胰腺β細胞中有數(shù)千個lncRNA。β細胞lncRNA通常是細胞類型特異性的并且在分化期間表現(xiàn)出動態(tài)調(diào)節(jié)。盡管這些特征暗示了lncRNA在β細胞基因調(diào)控和糖尿病中的作用，但β細胞lncRNA的功能仍然很大程度上未知。在這項研究中，我們使用轉(zhuǎn)錄物敲低和共表達網(wǎng)絡(luò)分析研究了β細胞特異性lncRNA和轉(zhuǎn)錄因子的功能。這揭示了與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用以調(diào)節(jié)β細胞特異性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的lncRNA。我們進一步證明lncRNA PLUTO影響局部3D染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和PDX1的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果暗示lncRNA參與β細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)。          

    轉(zhuǎn)錄組調(diào)查揭示了數(shù)萬種具有低蛋白質(zhì)編碼潛力的超過200個核苷酸的哺乳動物轉(zhuǎn)錄物。這些長鏈非編碼RNA中的一小部分已被證明通過調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄，剪接，mRNA轉(zhuǎn)運，穩(wěn)定性或翻譯來控制基因表達。因此，特定的lncRNA涉及各種關(guān)鍵過程，包括隨機X染色體失活，印記，細胞周期，器官發(fā)生，分化，多能性和癌癥進展。盡管具有廣泛的生物學(xué)作用，但真正具有功能的lncRNA的比例以及l(fā)ncRNA在人類生物學(xué)和疾病中的真實影響仍然知之甚少。

    為了直接測試胰腺β細胞lncRNA的調(diào)節(jié)功能，我們在葡萄糖響應(yīng)性人胰島β細胞系EndoC-βH1中進行了功能喪失實驗。我們選擇了人類模型，因為只有一些人類lncRNA是進化保守的，我們擾亂了lncRNA的功能通過基于RNAi的轉(zhuǎn)錄物敲低。

    選擇用于敲低的lncRNA來源于25個lncRNA，其顯示在人胰島中顯著富集的表達。在這25個lncRNA中，有12個入圍，因為它們附近位置有重要功能的蛋白質(zhì)編碼基因。然后，我們針對12種設(shè)計amiRNA序列。還獲得了五種必需的胰島TF（HNF1A，GLIS3，MAFB，NKX2.2和PDX1）的有效的amiRNA。（注意：作者找了一組候選lnc，依據(jù)臨近位置有重要編碼基因，挑選了12個lnc，而后設(shè)計敲低的siRNA）。

    正如預(yù)期的那樣，胰島TF的敲低始終產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄表型。值得注意的是，12個胰島lncRNA中的9個的敲低也引起轉(zhuǎn)錄變化。更詳細的分析顯示，一些呈現(xiàn)敲低表型的lncRNA對鄰近基因具有明顯的作用，表明可能的順式調(diào)節(jié)機制，盡管其他此類lncRNA似乎不影響鄰近基因，因此可能通過反式調(diào)節(jié)機制發(fā)揮作用。（注意：12個敲低的lnc中有9個引起變化）。

    為了深入了解由胰島特異性lncRNA和TF調(diào)控的表達程序，我們比較了它們的敲低基因表達表型。我們首先評估了在敲低不同胰島TF后發(fā)生的基因表達的變化，并且發(fā)現(xiàn)所有成對比較的高Pearson相關(guān)值。該發(fā)現(xiàn)與胰島特異性TF通常與常見基因組靶標結(jié)合并以組合方式起作用的概念一致。有趣的是，在抑制幾種lncRNA后發(fā)生的轉(zhuǎn)錄變化與抑制TF后觀察到的轉(zhuǎn)錄變化顯著相關(guān)。因此，這些基因敲低實驗的結(jié)果表明，選擇的胰島特異性lncRNA和TF可以調(diào)節(jié)共同的基因表達程序。（注意：作者敲低lnc，與TF，查看二者引起的基因變化是否相關(guān)）。

    最近的研究表明，胰島TF通過靶向增強子簇來調(diào)節(jié)細胞特異性轉(zhuǎn)錄。鑒于胰島lncRNAs和TFs的敲低表明它們調(diào)節(jié)相似的基因，我們研究胰島lncRNAs是否也調(diào)節(jié)增強子簇相關(guān)基因。正如預(yù)期的那樣，基因集富集分析（GSEA）顯示，具有胰島富集表達的基因，與增強子簇相關(guān)的基因，或與多個TF結(jié)合的增強子相關(guān)的基因在敲低所有五種TF后被下調(diào)，而在相似水平表達的10個基因?qū)φ战M中沒有觀察到這種情況。同樣地，與HI-LNC12,15,30,78,80,85和71敲低后下調(diào)的基因中富集與增強子簇相關(guān)的基因和顯示胰島特異性表達的基因。因此，這些結(jié)果表明胰島特異性TF和lncRNA通常共調(diào)節(jié)與增強子簇相關(guān)的基因。

    我們接下來使用獨立的實驗方法來驗證人β細胞lncRNA和TF調(diào)節(jié)共同基因表達程序的觀察結(jié)果。我們使用來自64個人胰島樣品的RNA測序（RNA-seq）譜的加權(quán)基因共表達分析（WGCNA）實施該分析。這確定了包含超過100個基因的25個主要基因模塊，命名為M1-M25，其在人胰島樣品中顯示出高度顯著的共表達（圖5A）。我們接下來確定哪些共表達模塊包含胰島lncRNA。不是使用我們先前定義的lncRNA組，而是使用一組2,373個β細胞lncRNA進行該分析，所述2,373個β細胞lncRNA使用從41個胰島樣品匯集的約50億個鏈RNA-seq讀數(shù)進行新注釋。發(fā)現(xiàn)β細胞lncRNA富集在七個胰島共表達模塊（M3，M7，M12，M13，M18，M20和M21）中（圖5B）。

    我們接下來描述了這七種富含lncRNA的共表達模塊的性質(zhì)。其中五個（M3，M7，M12，M18和M20）富含與胰島增強子簇相關(guān)的基因（圖5A-5C，標記為藍色）。另外兩個模塊（M13和M21）被富集用于mRNA翻譯和代謝通路中的普遍表達的基因。在富含lncRNA和增強子簇的模塊中，三個（M3，M7和M18）也富含胰島特異性TF基因（圖5D），這些模塊中的兩個（M3和M7）包含12個lncRNA中的9個，這些lncRNA在EndoC-βH1細胞中被敲低。模塊M3是七種富含lncRNA的模塊中最大的模塊，其特征在于與原型胰島細胞功能相關(guān)的基因本體論（GO），并含有幾個胰島TF和lncRNA（圖5E）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們發(fā)現(xiàn)許多胰島lncRNA和已知細胞特異性TF的實例顯示了人胰島樣品中基因表達水平的緊密相關(guān)性（圖5F;圖S5C）。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明β細胞特異性lncRNA，TF和與胰島增強子簇相關(guān)的基因構(gòu)成了共同表達程序的一部分。（注意：使用WGCNA依據(jù)相關(guān)性將轉(zhuǎn)錄因子與lncRNA關(guān)聯(lián)起來）。

    為了探索β細胞lncRNA如何調(diào)節(jié)細胞特異性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，我們專注于HI-LNC71，一種核富集的轉(zhuǎn)錄物，其從位于PDX1上游約3kb的啟動子轉(zhuǎn)錄，以反義方向。PDX1是胰腺發(fā)育和β細胞功能的必需轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（注意：找一個重要的轉(zhuǎn)錄因子作為靶標）?；谠摶蚪M位置，我們將HI-LNC71重命名為PDX1基因座上游轉(zhuǎn)錄物PLUTO。

    PLUTO的潛在重要性通過以下觀察得到加強：PLUTO是來自T2D或IGT供體的胰島中最顯著下調(diào)的lncRNA之一）。有趣的是，PDX1在來自T2D和IGT的供體的胰島中也被下調(diào)。

    PLUTO是一種多同種型轉(zhuǎn)錄物，其包含跨越接近100kb的五個主要外顯子，包括一群增強子，其與人胰島和EndoC-βH1細胞中的PDX1啟動子進行3D接觸。該觀察結(jié)果表明PLUTO可能影響PDX1基因的順式調(diào)節(jié)。

    為了測試PLUTO是否調(diào)節(jié)PDX1，我們首先在amiRNA介導(dǎo)的PLUTORNA敲低后檢查EndoC-βH1細胞，發(fā)現(xiàn)PDX1 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低。類似地，分散的原代人胰島細胞中PLUTORNA的敲低引起PDX1 mRNA的減少。為了通過互補方法驗證這些實驗，我們使用CRISPR干擾（CRISPRi），其涉及靶向基因轉(zhuǎn)錄起始位點下游的指導(dǎo)RNA（gRNA）以阻斷其轉(zhuǎn)錄。靶向PLUTO起始位點下游區(qū)域的兩個獨立的gRNA相對于非靶向gRNA有效地降低了PLUTO RNA水平，并且在兩種情況下，這導(dǎo)致PDX1 mRNA表達降低（圖6E）。因此，擾亂PLUTO RNA水平或其轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致對PDX1 mRNA的相同抑制作用。（注意：敲低過表達，說明lnc與靶基因表達量變化相關(guān)）。

    為了評估PLUTO功能的潛在機制，我們首先檢查了PLUTO是否控制PDX1的穩(wěn)定性或轉(zhuǎn)錄。使用放線菌素D的轉(zhuǎn)錄抑制實驗顯示在PLUTO敲低后PDX1mRNA的穩(wěn)定性沒有顯著差異。相反，在PLUTO敲低后內(nèi)含子PDX1RNA減少，表明PLUTO調(diào)節(jié)PDX1轉(zhuǎn)錄。

    因為PLUTO跨越增強子簇，我們假設(shè)它可以調(diào)節(jié)活性增強子的染色質(zhì)狀態(tài)。因此，我們敲低了β細胞中的PLUTO并測量了簇內(nèi)幾種增強子的H3K27乙?；约癏3K4單甲基化和三甲基化水平。我們的結(jié)果表明這些特征性活性染色質(zhì)標記沒有顯著變化。

    我們接下來確定PLUTO是否影響增強子簇和PDX1啟動子之間的3D接觸。使用定量染色質(zhì)構(gòu)象捕獲（3C）測定檢查PDX1基因座揭示兩個遠上游增強子在PLUTO敲低后顯示與PDX1啟動子的接觸減少。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明PLUTO調(diào)節(jié)PDX1的轉(zhuǎn)錄，并且這與其促進PDX1啟動子與其增強子簇之間的接觸的能力相關(guān)（圖7E）。

    在目前的研究中，我們已經(jīng)檢驗了lncRNAs在胰腺β細胞中的細胞特異性基因調(diào)控中發(fā)揮作用的假設(shè)，胰腺β細胞是人類糖尿病發(fā)病機制中的核心細胞類型。因此，我們首次對一組人β細胞特異性lncRNA的功能進行了系統(tǒng)分析。我們的實驗揭示了β細胞lncRNA的幾個例子，其中序列特異性擾動引起轉(zhuǎn)錄和功能表型。我們進一步顯示β細胞特異性lncRNA和TF調(diào)節(jié)共同的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。最后，我們已經(jīng)證明β細胞特異性lncRNA直接或間接參與人增強子簇的調(diào)節(jié)，這是胰島特異性轉(zhuǎn)錄因子的主要功能靶點和胰島細胞轉(zhuǎn)錄程序的關(guān)鍵順式調(diào)節(jié)決定因子。

其他相關(guān)文獻解讀

文獻解讀：lnc-Blnc1與EDF1和LXR蛋白質(zhì)形成復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控作用

文獻解讀：lncRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合促進其泛素化降解

文獻解讀：lncRNA通過其衍生的miRNA調(diào)控腫瘤進展

文獻解讀：lncRNA-MUF可以競爭性結(jié)合miR-34a促進EMT過程

文獻解讀：lncRNA ceRNA機制研究繼續(xù)

文獻解讀：lncRNA ceRNA機制怎么找分子

文獻解讀：Nature?Cell Biology: lncRNA ceRNA調(diào)控胃癌EMT過程（IF:19.064）

重磅首發(fā): TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA數(shù)據(jù)挖掘（含分析結(jié)果）