The Long Noncoding RNA CAREL Controls Cardiac Regeneration

長非編碼RNA CAREL控制心臟再生

期刊：J Am Coll Cardiol；影響因子：16.834    

發(fā)表單位：哈爾濱醫(yī)科大學                              

         心臟再生過程中是否有l(wèi)nc參與呢？本研究通過對發(fā)育中心臟做lnc表達譜篩選到lnc CAREL在新生小鼠的心肌細胞中顯著上調(diào)，機制研究發(fā)現(xiàn)該lnc通過ceRNA調(diào)控心臟再生。

         背景：由于心肌細胞有絲分裂的喪失，成年哺乳動物心臟在缺血性損傷后失去再生能力。然而，心肌細胞的有絲分裂后性質(zhì)的分子機制仍然很大程度上未知。

         目標：本研究的目的是確定lncRNAs在出生后和成人損傷期間心臟再生中的重要作用。

         結(jié)果：發(fā)現(xiàn)lncRNA CAREL在新生小鼠的心肌細胞中顯著上調(diào)，抑制再生能力。CAREL作為競爭性內(nèi)源性核糖核酸，結(jié)合miR-296抑制Trp53inp1和Itm2a（miR-296的靶基因）的表達。

         心肌梗死（MI）仍然是全世界人類死亡的主要原因，心臟功能受損和心力衰竭部分是由于心肌細胞丟失造成的。雖然干細胞移植已被提議作為一種治療方法來取代損傷后的凋亡心肌細胞，有效保留和分化宿主心肌中移植的干細胞仍然是一項重大挑戰(zhàn)。lncRNA是長度超過200個核苷酸的一組核糖核酸，其通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后的不同分子機制調(diào)節(jié)基因和/或基因產(chǎn)物/蛋白質(zhì)的功能和水平。lncRNA參與多種生物過程，例如細胞增殖，細胞凋亡，基因組印記，細胞命運測定，RNA替代剪接和染色質(zhì)修飾。

         首先進行微陣列分析以鑒定出生后第1天（P1）至第7天（P7）的小鼠心臟中異常調(diào)節(jié)的lncRNA。發(fā)現(xiàn)總共128個異常調(diào)節(jié)的lncRNA。然后進行qPCR以確定P7上8個lncRNA的顯著上調(diào)（> 5倍）。這8個lncRNA中的一個是748個核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，其含有在心肌細胞的細胞質(zhì)中表達的3個片段為方便起見，我們將這種lncRNA命名為“心臟再生相關(guān)的lncRNA”（CAREL）。來自P1，P3，P7和P10的出生后心臟以及在P1，P3和P7的出生后心臟中分離的左心室肌細胞中CAREL水平逐漸增加。生物信息學分析排除了CAREL基因編碼序列中主要開放閱讀框的存在。（注意：作者對小鼠芯片做芯片篩選差異表達的lncRNA，尋找與心臟發(fā)育相關(guān)的lncRNA）。

         使用Myh6驅(qū)動的心肌細胞特異性CAREL轉(zhuǎn)基因（TG）小鼠探索CAREL上調(diào)在出生后心臟    發(fā)育和再生中的功能作用。正如所料，與野生型（WT）對照同窩小鼠相比，CAREL TG小鼠心臟中CAREL豐度顯著增加。然而，心肌細胞的增殖能力明顯降低，但CAREL TG小鼠的心肌細胞大小明顯增大。有趣的是，在P1處進行頂端切除后的P21，心臟CAREL過表達導致TG小鼠心肌瘢痕增加，心肌細胞增殖受抑制，并且相對于WT小鼠中的心肌細胞面積增大。結(jié)果表明，新生兒心臟中CAREL的心臟過度表達足以導致心臟再生能力的喪失。此外，P1新生小鼠心肌細胞中的CAREL過表達顯示出增殖能力的顯著降低。（注意：小鼠lnc過表達證明其對心臟再生的抑制）。

         研究了CAREL敲低對MI期間心肌細胞復制和心臟再生的影響。通過心肌內(nèi)施用腺病毒shRNA（Ad-shCAREL）成功沉默心臟中CAREL的表達。在心肌梗死后第14天，Ad-shCAREL誘導的PALL對CARI的缺乏顯著降低了心肌瘢痕大小，改善了射血分數(shù)（EF）和縮短分數(shù)（FS），同時伴隨著有絲分裂活性（pH3 +染色）和心肌細胞胞漿分裂的增加，橫截面積減。這些數(shù)據(jù)表明CAREL缺陷促進了新生兒心臟受傷后的心臟再生。Ad-shCAREL顯著減少了瘢痕大小，促進了心肌細胞的增殖，并增強了心臟梗塞后心肌的心臟再生。

    我們接下來探討了沉默CAREL后心肌細胞是否可以重新進入細胞周期。如圖3K所示，Ad-shCAREL在P7新生小鼠心肌細胞中腺病毒介導的CAREL沉默顯著增加了增殖能力，正如DNA合成，心肌細胞有絲分裂和胞質(zhì)分裂增加所表明的那樣。數(shù)據(jù)表明，CAREL的敲低可以誘導缺血性心肌損傷的出生后小鼠心肌細胞分裂和心臟再生的再激活。（注意：小鼠lnc敲低證明其對心臟再生的促進）。

         最近的研究表明，lncRNA可以通過序列互補機制通過結(jié)合和吸收miRNA而充當海綿或競爭內(nèi)源核糖核酸（ceRNA），從而影響靶miRNA的靶基因的表達。因此，我們建立了以下實驗來破譯CAREL作用的潛在miRNA機制。

         首先，我們的生物信息學分析預測CAREL結(jié)合的miRNA，包括miR-344，-135b，-705，-296和-760。這個結(jié)果促使我們測試CAREL是否可以作為這些miRNA的ceRNA。我們的體外功能研究表明，miR-296模擬物（ago-296）增加了心肌細胞增殖，但miR-344，-135b，-705和-760模擬物沒有增加。其次，熒光素酶測定和生物素-抗生物素蛋白下拉測定證實miR-296可以與HEK293細胞以及新生兒心肌細胞中的CAREL相互作用。此外，通過其反義寡核苷酸（anta-296）消耗內(nèi)源性miR-296顯著抑制來自P1心臟的心肌細胞的增殖和有絲分裂。與有絲分裂減弱相一致，ago-296使雙核心肌細胞的數(shù)量也明顯減少；相反，它在用anta-296轉(zhuǎn)染的心肌細胞中增加。這些結(jié)果表明miR-296促進了心肌細胞的增殖。（生信預測潛在miR，對潛在miR過表達，看其是否可以對心肌細胞增殖有影響，找到miR-296，而后pull-down，螢光素酶實驗證實lnc-CAREL與miR-296直接相互作用）。

         此外，沉默CAREL增加了心肌細胞的增殖，并且anta-296消除了這種有利的作用。相反，miR-296與ago-296過表達消除了由新生兒心室肌細胞中CAREL的強制表達誘導的心肌細胞復制的減少。結(jié)果表明miR-296介導CAREL在出生后心肌細胞增殖和心臟再生中的調(diào)節(jié)作用。（注意：lnc-CAREL，miR-296彼此過表達敲低，證明二者在功能上符合ceRNA相關(guān)性）。

         為了進一步了解介導CAREL和miR-296作用的信號分子，我們進行了以下分析。我們首先使用Targetscan和miRDB數(shù)據(jù)庫進行理論分析，以確定miR-296的潛在靶基因。（注意：軟件預測miR的靶基因）。通過這種方式，我們將Trp53inp1，Itm2a，Cep97和Gas7鑒定為候選基因，其在3'非翻譯區(qū)（3'UTR）中具有用于miR-296結(jié)合的種子位點。我們接下來通過以下步驟實驗性地建立Trp53inp1和Itm2a作為miR-296的靶基因。首先，miR-296的過表達降低了P1新生心肌細胞中Trp53inp1和Itm2a的蛋白質(zhì)水平，但沒有降低Gas7和Cep97的蛋白質(zhì)水平。相反，miR-296的沉默上調(diào)Trp53inp1和Itm2a蛋白水平，但不影響Gas7和Cep97的表達（注意：判斷候選靶基因的表達是否隨miR-296的變化而變化，從相關(guān)性上判斷是否是靶基因）。此外，心肌細胞的細胞周期活性被Trp53inp1或Itm2a抑制，但不被Gas7和Cep97抑制。此外，熒光素酶測定顯示miR-296減少了攜帶Trp53inp1或Itm2a的3'UTR的載體引發(fā)的熒光素酶活性（圖8G）。這些數(shù)據(jù)表明Trp53inp1和Itm2a是CAREL-miR-296軸的下游靶基因。（注意：熒光素酶實驗證明miR與靶基因UTR取結(jié)合）。

         lncRNA CAREL由3個片段產(chǎn)生，我們命名為A，B和C。為了詳細說明這些片段參與調(diào)節(jié)心肌細胞增殖和心臟再生，我們分析了每個片段對CAREL誘導的心肌細胞周期停滯的貢獻。我們發(fā)現(xiàn)片段C的強制表達，而不是片段A和B的強制表達，這導致心肌細胞增殖的抑制。更引人注目的是，miR-296在CAREL上的結(jié)合位點在小鼠和人之間是保守的，并且恰好落在片段C內(nèi)。（注意：研究lncRNA的哪個外顯子在發(fā)揮作用，找到保守的區(qū)段）。

         長期以來人們一直認為，成年哺乳動物心臟失去了再生受損心肌的能力，并且通常會在受損后形成持續(xù)的纖維性瘢痕并發(fā)展為收縮性心力衰竭。然而，這一概念受到最近研究的挑戰(zhàn)，這些研究表明，未成熟的哺乳動物心臟不是有絲分裂后器官，并且通過促進心肌細胞增殖維持了再生受損心臟的瞬時能力。目前的工作證實了這些發(fā)現(xiàn)，并揭示出生后CAREL的上調(diào)導致心肌細胞增殖能力和心臟再生的喪失。我們的結(jié)果進一步證明CAREL通過直接結(jié)合機制通過靶向Trp53inp1和Itm2a來調(diào)節(jié)心肌細胞有絲分裂，從而充當miR-296的ceRNA。

文獻解讀：食管癌lncRNA-TTN-AS1競爭性結(jié)合miR-133b上調(diào)Snail1的表達，促進EMT過程