Long noncoding RNA licensing of obesity-linked hepatic lipogenesis and NAFLD pathogenesis

長鏈非編碼RNA誘導(dǎo)與肥胖相關(guān)的肝脂肪生成和NAFLD發(fā)病機制

期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影響因子：12.353  

發(fā)表單位：密歇根大學(xué) 

    上期我們介紹“lncRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合促進其泛素化降解”lnc與蛋白質(zhì)結(jié)合促進其泛素化降解，進而影響靶基因的機制。本研究發(fā)現(xiàn)lnc與EDF1和LXR蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，增強其轉(zhuǎn)錄活性，激活肝脂肪生成基因。同樣從lnc與蛋白質(zhì)結(jié)合的角度研究lncRNA的機制。

通過激活LXR-SREBP1c通路在非酒精性脂肪肝病（NAFLD）中異常誘導(dǎo)肝臟脂肪生成。迄今為止，已經(jīng)闡明了許多影響LXR和SREBP1c轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子。然而，這種調(diào)節(jié)軸是否與長非編碼RNA（lncRNA）相互作用仍然很大程度上未被探索。在這里，我們顯示lncRNA Blnc1的肝臟表達在肥胖和小鼠的NAFLD中強烈升高。Blnc1是響應(yīng)LXR活化誘導(dǎo)SREBP1c和肝脂肪生成基因所必需的。對Blnc1核糖核蛋白復(fù)合物的蛋白質(zhì)組分分析鑒定出EDF1是LXR轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組分，其與Blnc1協(xié)同作用以激活脂肪生成基因程序。這些發(fā)現(xiàn)說明了lncRNA促進肝脂肪生成加劇胰島素抵抗和NAFLD。

    非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是代謝綜合征的普遍肝臟表現(xiàn)，其范圍從簡單的脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NAFLD發(fā)病機制涉及幾種致病機制，包括胰島素抵抗，線粒體功能障礙，脂毒性和內(nèi)毒素暴露。由于脂肪組織功能障礙導(dǎo)致脂質(zhì)通量升高，這種從頭脂質(zhì)合成的增加加劇了胰島素抵抗狀態(tài)下的肝脂肪變性。肝X受體（LXR）和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP1c）是肝臟脂肪生成基因程序的中心調(diào)節(jié)因子。已揭示LXR-SREBP1c通路的關(guān)鍵蛋白質(zhì)組分，其介導(dǎo)LXR的轉(zhuǎn)錄激活和SREBP1c的營養(yǎng)和激素調(diào)節(jié)。然而，LXR-SREBP1c軸是否與長鏈非編碼RNA（lncRNAs）相互作用仍然未知。

    我們以前證明保守的lncRNA Blnc1調(diào)節(jié)棕色和米色脂肪細胞分化和產(chǎn)熱。有趣的是，在肝臟中觀察到豐富的Blnc1表達，估計每個小鼠肝細胞約120個拷貝，提高了它可能以組織特異性方式協(xié)調(diào)不同的代謝反應(yīng)的可能性。為了探索這一點，我們首先檢查了飲食誘導(dǎo)和遺傳性肥胖小鼠肝臟Blnc1表達是否發(fā)生了改變。定量PCR分析顯示，高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)的小鼠和瘦蛋白缺乏（ob/ob）和瘦蛋白受體缺陷（db/db）肥胖小鼠的肝臟中Blnc1表達顯著升高。Blnc1的這種增加的表達與誘導(dǎo)Srebp1c（脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子）和脂肪生成基因（包括脂肪酸合酶（Fasn）和硬脂酰-CoA去飽和酶1（Scd1））的增加的表達相關(guān)。肝臟Blnc1表達與肥胖和肝臟甘油三酯（TAG）含量強烈相關(guān)。與在HFD喂養(yǎng)后表現(xiàn)出更明顯的肥胖的那些相比，低體重的獲得者在肝臟中具有更低的Blnc1表達。這些結(jié)果表明肝臟Blnc1表達與肥胖和肝臟脂肪變性密切相關(guān)。

    lncRNAs是否在肝臟脂肪生成和NAFLD發(fā)病機制的生理調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用尚未建立。原代肝細胞中Blnc1的腺病毒過表達顯著增強了合成LXR激動劑T0901317對Srebp1c和Fasn的誘導(dǎo)。與脂肪細胞類似，Blnc1主要定位于肝細胞核中（注意：定位在細胞核說明該lnc與染色體，基因轉(zhuǎn)錄等相關(guān)）。免疫印跡和qPCR分析顯示，Blnc1強烈誘導(dǎo)SREBP1的前體和加工核同種型以及負責從頭脂肪生成和脂質(zhì)儲存的基因表達，包括Srebp1c，Fasn，Scd1，Fsp27，Dgat2和Fabp4。此外，Blnc1誘導(dǎo)了幾種其他LXR靶基因（Abca1，Abcg5，Lpcat3和Rnf145）的mRNA表達。這些結(jié)果表明，Blnc1足以刺激培養(yǎng)的肝細胞和肝臟中的體內(nèi)新生脂肪生成（注意：對lnc Blnc1進行過表達或敲低，研究Blnc1改變后，脂肪合成/存儲相關(guān)的基因，調(diào)節(jié)因子LXR和SREBP1c，及其靶基因的變化。分子水平上說明lnc與脂肪合成相關(guān)，與調(diào)節(jié)脂肪的通路相關(guān)）。

    我們觀察到Blnc1與LXR協(xié)同作用提高了它可能作為驅(qū)動肝臟脂肪生成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵lncRNA組分的可能性。肝臟基因表達分析表明，Blnc1失活顯著降低了Srebp1c，F(xiàn)asn，Scd1，F(xiàn)sp27，Abca1和Abcg5的mRNA誘導(dǎo)。LXR激動劑對SREBP1蛋白表達的誘導(dǎo)也在Blnc1 KO小鼠肝臟中減弱。肝臟脂肪生成對于喂食是高度可誘導(dǎo)的。

    由于已知Blnc1調(diào)節(jié)棕色脂肪產(chǎn)熱，重要的是確定它通過細胞自發(fā)機制對肝臟脂肪生成發(fā)揮作用。我們在從WT和Blnc1缺失小鼠分離的原代肝細胞中進行LXR激動劑治療。與體內(nèi)研究類似，LnR介導(dǎo)的脂肪生成反應(yīng)在Blnc1缺陷型肝細胞中顯著受損，導(dǎo)致14C標記的乙酸鹽摻入脂質(zhì)中較低。這些結(jié)果有力地表明Blnc1和LXR可協(xié)同作用以在肝細胞中引發(fā)完全的脂肪生成反應(yīng)。

    為了確定Blnc1缺陷對肝轉(zhuǎn)錄組的全局影響，我們進行了RNA測序分析并鑒定了在Blnc1失活后上調(diào)或下調(diào)的基因列表（圖7a）。GO分析表明，下調(diào)的基因富含膠原纖維組織，血管生成，細胞粘附，脂肪生成和細胞死亡，與肝損傷和纖維化相關(guān)的通路（圖7b）。為了進一步支持這一點，qPCR分析表明，在肝臟特異性Blnc1缺失的小鼠中，參與脂肪生成，肝纖維化和炎癥的基因的mRNA表達顯著降低（圖7c-e）。上調(diào)的基因富含環(huán)氧化酶p450通路，氧化和還原過程以及脂質(zhì)和異生物質(zhì)代謝（圖7b），表明Blnc1缺乏可改善肝臟解毒和不同脂質(zhì)物種的轉(zhuǎn)化。與對照相比，在Blnc1 LKO小鼠肝臟中前體和加工的SREBP1同種型的蛋白質(zhì)水平降低（圖7d）。此外，在Blnc1 LKO小鼠肝臟中減弱JNK1 / 2磷酸化和細胞死亡標記物（PARP和CASPASE 3切割）?？傊?，這些數(shù)據(jù)說明了Blnc1在飲食誘導(dǎo)的NASH進展的發(fā)病機制中的重要功能。（注意：為了解Blnc1發(fā)揮的功能，作者敲低Blnc，而后轉(zhuǎn)錄組測序，對得到的差異基因進行GO，KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與脂肪、肝纖維化，炎癥等相關(guān)的生物學(xué)過程變化，完全符合之前的實驗）。

    已知LncRNA形成核糖核蛋白復(fù)合物以發(fā)揮其生物學(xué)作用。接下來，我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定與肝臟中的Blnc1物理相關(guān)的蛋白質(zhì)因子。我們在肝特異性TBG啟動子下構(gòu)建了表達鏈霉抗生物素蛋白適體標記的Blnc1（StA-Blnc1）的重組AAV。我們使用鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖珠分離來自用對照（AAV-GFP）或AAV-StA-Blnc1轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠的肝核和親和純化的Blnc1相關(guān)蛋白，然后進行質(zhì)譜分析。我們將Y-box結(jié)合蛋白1（YBX1）和內(nèi)皮分化相關(guān)因子1（EDF1）鑒定為兩種特異性的Blnc1相互作用蛋白。通過對肝臟中內(nèi)源蛋白質(zhì)的共免疫沉淀（共-IP）分析證實了StA-Blnc1和YBX1與EDF1之間的相互作用。此外，IP/qPCR研究表明肝臟中內(nèi)源性YBX1和EDF1的免疫復(fù)合物富集了Blnc1 RNA。我們還觀察到Blnc1與異種核核糖核蛋白U（hnRNPU）物理結(jié)合，這是一種已知與Blnc123相互作用的蛋白質(zhì)，表明hnRNPU可能是Blnc1核糖核蛋白復(fù)合物的核心成分（注意：通過類似RNA pull-down的實驗尋找lncRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)）。

    EDF1是一種RNA結(jié)合蛋白，之前曾報道與核激素受體相互作用，包括LXRα。我們接下來檢查了LXRα，EDF1和Blnc1之間的物理和功能關(guān)系。我們用單獨或組合表達Blnc1和HA標記的EDF1或LXRα的質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，并使用α-HA瓊脂糖珠進行IP/qPCR測定。該蛋白質(zhì)-RNA相互作用測定表明Blnc1與EDF1和LXRα形成物理復(fù)合物。Blnc1和LXRα之間的關(guān)聯(lián)似乎是配體非依賴性的。相反，我們在鏈霉抗生物素蛋白珠沉淀來自瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞的裂解物后檢測到Blnc1核糖核蛋白復(fù)合物中的EDF1和LXRα。這些蛋白質(zhì)-RNA相互作用研究表明Blnc1與EDF1和LXR形成核糖核蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。

    我們接下來解剖了Blnc1的RNA結(jié)構(gòu)域（RD），其介導(dǎo)其與LXRα和EDF1的相互作用。我們以前證明RD1是與hnRNPU和脂肪形成功能相互作用所必需的。有趣的是，該片段的缺失不會損害Blnc1和LXRα與EDF1之間的相互作用。為了評估EDF1可能促進Blnc1募集到LXR轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的可能性，我們進行RNA沉淀，然后在瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞中進行免疫印跡。EDF1的共表達增加了LXRα向沉淀的Blnc1 RNA復(fù)合物的募集。一致地，IP/qPCR測定表明通過EDF1共表達顯著增加了Blnc1向LXRα的募集。

    已知EDF1充當多種轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄共激活因子。Blnc1可能促進EDF1對LXR的募集和共活化。為了測試這一點，我們在存在或不存在Blnc1的情況下在HEK293T細胞中轉(zhuǎn)染HA-LXRα和Flag-EDF1。我們檢測到LXRα和EDF1之間的物理關(guān)聯(lián)，其通過Blnc1表達進一步增強。與對照肝細胞相比，缺乏Blnc1的肝細胞中LXRα和EDF1之間的物理相互作用顯著降低。熒光素酶報告基因測定表明EDF1與LXRα/RXRβ協(xié)同作用以刺激Srebp1c啟動子活性，并且Blnc1進一步增強該轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的活性。此外，染色質(zhì)免疫沉淀研究表明，在沒有Blnc1的情況下，LXRα向近端Srebp1c啟動子上的LXR結(jié)合位點的募集受到很大損害。這些結(jié)果說明了肝細胞中LXRα，EDF1和Blnc1之間的緊密物理和功能相互作用（注意：作者釣取到Blnc1結(jié)合蛋白復(fù)合物，根據(jù)蛋白復(fù)合物，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能，使用Chip實驗尋找該復(fù)合物作用的靶基因）。

    為了確定Blnc1在介導(dǎo)EDF1中的作用，我們使用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)在原代肝細胞中過表達EDF1。在基礎(chǔ)和LXR激活條件下，肝細胞中的EDF1過表達刺激脂肪生成基因表達。Blnc1的共表達進一步增強了EDF1對脂肪生成基因表達的刺激作用。重要的是，EDF1誘導(dǎo)的脂肪生成基因表達在缺乏Blnc1的肝細胞中顯著減弱。最后，我們使用在用GFP或Blnc1腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的原代肝細胞中的兩個獨立的siRNA庫進行EDF1的siRNA敲低。qPCR分析顯示，與對照相比，兩種siRNA均顯著降低內(nèi)源性EDF1表達。重要的是，通過EDF1的siRNA敲低，Blnc1和LXR激動劑對Srebp1c和Fasn表達的誘導(dǎo)顯著減弱，表明EDF1是LXR和Blnc1完全脂肪生成激活所必需的?？傊?，這些結(jié)果概述了EDF1促進Blnc1募集和LXR核糖核蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成的分子機制（圖10d）（Srebp1c是調(diào)控與脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，LXR可以激活該基因表達，LXR蛋白在促進Srebp1c時想必可能不是孤立的，其中可能有l(wèi)nc, circ或者其他分子形成復(fù)合物。假如通過Rip實驗釣取LXR的結(jié)合RNA，而后進行研究，可能這個文章容易做的多。我們會發(fā)現(xiàn)文章的寫作思路一般是發(fā)現(xiàn)lnc，過表達敲低說明lnc功能，而后尋找lnc結(jié)合蛋白，最終尋找的蛋白依然是該生物學(xué)過程中明星分子。真實實驗中會篩選到幾十幾百個差異的lnc，要挨個試嗎？如果按照這種思路不知道要試驗多少個lnc，才能找到一個有重要功能的lnc。每個生物學(xué)過程中都會有關(guān)鍵性的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子，不妨先從這些蛋白著手，反推調(diào)控他的上游分子，而后Rip實驗，就能找到那個lnc，circ）。

    肝脂肪生成的異?；罨c肥胖，特別是NAFLD中代謝紊亂的發(fā)病機理有關(guān)。然而，控制脂肪生成程序的生理和病理活化的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)仍然未完全了解。LncRNA正在成為一類重要的新型調(diào)節(jié)因子，它會影響代謝疾病的多種生物過程和發(fā)病機制。這些功能性RNA通過形成核糖核蛋白復(fù)合物與蛋白質(zhì)因子結(jié)合，以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄。迄今為止，僅鑒定了少量功能性lncRNA來調(diào)節(jié)代謝組織發(fā)育和代謝生理學(xué)。 lncRNAs是否在控制肝臟脂肪生成和NAFLD發(fā)病機制中發(fā)揮作用仍然是未知的。在本研究中，我們證明Blnc1是LXR / SREBP1c通路的核心組分，是胰島素抵抗狀態(tài)下脂肪生成誘導(dǎo)所必需的。

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