Mesenchymal stem cells promote hepatocarcinogenesis via lncRNA-MUF interaction with ANXA2 and miR-34a

間充質(zhì)干細(xì)胞通過lncRNA-MUF與ANXA2和miR-34a相互作用促進(jìn)肝癌發(fā)生

期刊：CancerResearch；影響因子：9.13            

發(fā)表單位：北京工業(yè)大學(xué) 

    間充質(zhì)干細(xì)胞有助于肝細(xì)胞癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，那么在發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中是否有l(wèi)ncRNA發(fā)揮作用呢，本研究通過lnc表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)lncRNA-MUF發(fā)揮重要作用，機制上lncRNA-MUF既可以直接與蛋白ANXA2結(jié)合激活Wnt/β-catenin信號和EMT通路，另外，lncRNA-MUF可以競爭性結(jié)合miR-34a發(fā)揮ceRNA作用上調(diào)Snail1表達(dá)，促進(jìn)EMT過程。

    越來越多的證據(jù)表明癌癥相關(guān)的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）有助于肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。我們鑒定了一種新的lncRNA，我們稱之為lncRNA-MUF，其在HCC組織中高度表達(dá)并且與不良預(yù)后相關(guān)。在HCC細(xì)胞中敲低lncRNA-MUF抑制EMT并抑制其致瘤潛力。相反，lncRNA-MUF過表達(dá)加速了EMT和惡性能力。機理研究表明，lncRNA-MUF結(jié)合膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）并激活Wnt/β-catenin信號和EMT。此外，lncRNA-MUF充當(dāng)miR-34a的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），導(dǎo)致Snail1上調(diào)和EMT活化。

    肝細(xì)胞癌（HCC）是全球第五大常見癌癥，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA可通過多種機制參與許多生理或病理過程，包括RNA-蛋白或RNA-RNA相互作用。據(jù)報道，失調(diào)的lncRNA可調(diào)節(jié)HCC增殖，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而，lncRNA在MSC介導(dǎo)的肝癌發(fā)生中的作用仍然未知。

    癌癥相關(guān)的MSCs作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分正日益受到重視，但HCC-MSCs在HCC進(jìn)展中的作用報道較少。在這里，我們發(fā)現(xiàn)HCC-MSCs通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)顯著增強HCC細(xì)胞的腫瘤球形成。我們研究了HCC-MSC與HCC細(xì)胞（GFP）之間相互作用的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示癌癥干細(xì)胞（CSC）標(biāo)志物如CD90和CD13被HCC-MSC顯著誘導(dǎo)。為了進(jìn)一步評估體內(nèi)HCC-MSC的CSC促進(jìn)作用，通過在裸鼠中皮下接種熒光素酶標(biāo)記的SMMC-7721細(xì)胞，與HCC-MSC混合或不與HCC-MSC混合，進(jìn)行有限稀釋致瘤性測定。

    當(dāng)皮下接種1×106個SMMC-7721或HepG2細(xì)胞時，HCC-MSC共接種組中的腫瘤重量顯著增強。此外，肝臟部位的生物發(fā)光強度和轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)均表明HCC-MSC顯著促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果提供了強有力的證據(jù)，表明當(dāng)與HCC-MSC共培養(yǎng)時，HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楦吖粜缘谋硇?/span>。

    為了解HCC-MSCs如何促進(jìn)HCC進(jìn)展的機制，我們使用微陣列分析來評估與HCC-MSC共培養(yǎng)的HCC細(xì)胞中lncRNA和mRNA的變化（圖2A）。轉(zhuǎn)錄組譜分析鑒定出當(dāng)與HCC-MSC共培養(yǎng)時，57個lncRNA轉(zhuǎn)錄物（圖2B）和110個mRNA在三種不同的HCC細(xì)胞系中差異表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)保存在Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫（GSE86160）中。到目前為止，大多數(shù)lncRNA仍然沒有表征，我們首先研究了由HCC-MSC誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞的改變的mRNA?；蚣患治觯?/span>GSEA）和基因本體論（GO）均表明差異表達(dá)的mRNA富含細(xì)胞外基質(zhì)，與EMT信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。另外，qPCR和蛋白質(zhì)印跡試驗證實，HCC-MSC條件培養(yǎng)基顯著上調(diào)EMT相關(guān)基因。TGF-β1是一種表征良好的EMT誘導(dǎo)劑，可作為陽性對照。我們的研究結(jié)果表明，HCC-MSCs可能通過EMT過程在很大程度上促進(jìn)HCC惡性腫瘤。

    為了進(jìn)一步鑒定哪些lncRNA可能在促進(jìn)HCC進(jìn)展的HCC-MSC中起重要作用，使用以下標(biāo)準(zhǔn)篩選候選lncRNA：lncRNA微陣列中的HCC-MSC顯著改變的lncRNA（圖2B）;和癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫表明與鄰近的非腫瘤組織相比，HCC樣本中lncRNA的差異表達(dá)（圖2C）。在五種最差異表達(dá)的lncRNA中，新的lncRNA（LINC00941，EnsemblID：ENSG00000235884，倍數(shù)變化>5和P<0.01）特別引起我們的注意（圖2D）。由于這是一種無特征的lncRNA，我們將其稱為lncRNA-MUF。與微陣列結(jié)果一致，qPCR測定證實HCC-MSC在HCC細(xì)胞中lncRNA-MUF顯著上調(diào)。另外，與鄰近的非腫瘤組織相比，它在HCC樣本中高度表達(dá)（圖2E）。TCGA數(shù)據(jù)（圖2F）和我們之前的lncRNA微陣列證實了這些結(jié)果。值得注意的是，Kaplan-Meier生存分析表明高lncRNA-MUF表達(dá)與HCC患者的不良生存相關(guān)（圖2F）。此外，HCC-MSC條件培養(yǎng)基和TGF-β1顯著增強了lncRNA-MUF的表達(dá)（圖2G）。此外，lncRNA-MUF在腫瘤球和高侵襲性HCC細(xì)胞中高度表達(dá)（圖2G）。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明lncRNA-MUF被HCC-MSC顯著上調(diào)。

    通過cDNA末端測定（RACE）的5'和3'快速擴增確定1884堿基對（bp）轉(zhuǎn)錄物，并且顯示無編碼潛力，如通過CNCI，CPAT和PhyloCSF評分分析所確定的。細(xì)胞組分和RNA熒光原位雜交（RNA-FISH）分析表明lncRNA-MUF定位于細(xì)胞質(zhì)中。敲除lncRNA-MUF顯著減弱了體外腫瘤球形成和侵襲的能力。此外，lncRNA-MUF敲低顯著抑制了體內(nèi)皮下異種移植物形成和轉(zhuǎn)移能力。相反，在lncRNA-MUF過表達(dá)細(xì)胞中腫瘤球形成增加。鑒于HCC-MSCs刺激EMT過程，我們檢測了lncRNA-MUF改變后EMT相關(guān)基因的表達(dá)。qPCR和蛋白質(zhì)印跡均證明lncRNA-MUF敲低顯著抑制間充質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)，而lncRNA-MUF過表達(dá)具有相反的作用?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-MUF可以調(diào)節(jié)EMT程序以促進(jìn)HCC進(jìn)展。

    LncRNAs可通過RNA-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮功能，調(diào)節(jié)靶基因。因此，我們利用RNA pull-down測定，然后銀染和質(zhì)譜（MS）來鑒定lncRNA-MUF-蛋白相互作用。發(fā)現(xiàn)ANXA2特異性結(jié)合lncRNA-MUF。通過RNA pull-down測定然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，在生物素標(biāo)記的有義lncRNA-MUF組中檢測到ANXA2。此外，通過RNA免疫沉淀（RIP）測定驗證了lncRNA-MUF和ANXA2之間的相互作用。另外，構(gòu)建一系列截短的lncRNA-MUF以繪制lncRNA-MUF和ANXA2之間的特異性結(jié)合區(qū)域，表明lncRNA-MUF的核苷酸800至1600可以結(jié)合ANXA2。競爭性RNA pull-down測定進(jìn)一步證實了ANXA2與lncRNA-MUF的相互作用。此外，RNA-FISH和免疫熒光測定表明lncRNA-MUF與ANXA2在HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中共定位。GEO數(shù)據(jù)顯示ANXA2在HCC組織和轉(zhuǎn)移樣品中高度表達(dá)。ANXA2的消耗顯著抑制腫瘤球形成和致腫瘤性。這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-MUF-ANXA2軸可以調(diào)節(jié)HCC進(jìn)展。

    為了研究lncRNA-MUF-ANXA2軸促進(jìn)HCC進(jìn)展的機制，我們檢查了ANXA2改變后EMT相關(guān)基因的表達(dá)。通過ANXA2過表達(dá)或敲低顯著改變間充質(zhì)相關(guān)基因和β-連環(huán)蛋白。不同細(xì)胞區(qū)室中的β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)不同的細(xì)胞功能，因此我們確定ANXA2是否影響β-連環(huán)蛋白的亞細(xì)胞分布。蛋白質(zhì)印跡分析顯示過表達(dá)ANXA2的細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠和細(xì)胞核中β-連環(huán)蛋白的增加。相反，在ANXA2敲低細(xì)胞中，細(xì)胞核中的β-連環(huán)蛋白顯著降低。此外，我們研究了lncRNA-MUF的效果在GSK-3β和ANXA2之間的相互作用，并發(fā)現(xiàn)lncRNA-MUF的敲低抑制ANXA2對β-catenin和EMT相關(guān)蛋白的促進(jìn)作用。另外，co-IP測定證實，lncRNA-MUF過表達(dá)顯著增強ANXA2和GSK-3β之間的相互作用，而lncRNA-MUF消耗抑制結(jié)合效應(yīng)。對lncRNA-MUF截短的分析表明，GSK-3β而非β-連環(huán)蛋白與lncRNA-MUF的核苷酸800至1200結(jié)合，表明lncRNA-MUF通過不同但部分重疊的結(jié)構(gòu)域與ANXA2和GSK-3β相互作用?？傊?，lncRNA-MUF和ANXA2的結(jié)合在Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)和EMT過程的激活中起重要作用。

    新出現(xiàn)的證據(jù)表明，細(xì)胞質(zhì)lncRNA可以作為調(diào)節(jié)miRNA功能的ceRNA。為了檢查細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA-MUF是否可以結(jié)合內(nèi)源性miRNA，我們使用PITA和RNAhybrid軟件預(yù)測了靶miRNA。僅選擇具有高等級靶位點和在HCC組織中低表達(dá)的miRNA用于進(jìn)一步分析。RIP和RNA pull-down測定顯示，與對照相比，miR-34a和miR-133a在lncRNA-MUF組中顯著富集。我們的初步結(jié)果顯示miR-34a比miR-133a更顯著地抑制腫瘤球形成。因此，我們主要關(guān)注lncRNA-MUF與miR-34a結(jié)合的影響。熒光素酶活性和AGO2RIP測定顯示lncRNA-MUF可與miR-34a結(jié)合。此外，RNA-FISH分析證明lncRNA-MUF與HCC細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的miR-34a共定位。接下來，我們發(fā)現(xiàn)miR-34a抑制腫瘤球形成和HCC細(xì)胞的腫瘤生長。此外，當(dāng)lncRNA-MUF和miR-34a共轉(zhuǎn)染到HCC細(xì)胞中時，lncRNA-MUF顯著地挽救了miR-34a對腫瘤球形成和侵襲的抑制作用。此外，qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析顯示lncRNA-MUF可以恢復(fù)miR-34a對EMT過程的抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明在HCC細(xì)胞中lncRNA-MUF作為影響miR-34a功能的ceRNA。

    為了進(jìn)一步闡明lncRNA-MUF-miR-34a軸對HCC進(jìn)展的貢獻(xiàn)的機制，Target Scan軟件預(yù)測Snail1是miR-34a的靶標(biāo)之一。并且miR-34a顯著抑制Snail1在HCC細(xì)胞中的表達(dá)，熒光素酶報告基因測定表明miR-34a可以結(jié)合Snail1的3'非翻譯區(qū)（UTR）。重要的是，lncRNA-MUF減弱了miR-34a與Snail1的3'UTR的結(jié)合能力。此外，Western印跡分析證實，lncRNA-MUF可降低miR-34a對Snail1表達(dá)的抑制作用。另外，Snail1敲低抑制由lncRNA-MUF過表達(dá)誘導(dǎo)的腫瘤球形成。qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析證明Snail1敲低抑制了lncRNA-MUF對EMT進(jìn)展的促進(jìn)作用?？傊@些數(shù)據(jù)顯示lncRNA-MUF可以作為miR-34a的ceRNA起作用以調(diào)節(jié)Snail1的表達(dá)并增強EMT過程。

    在這項研究中，我們研究了lncRNAs在促進(jìn)HCC進(jìn)展的HCC-MSCs中的作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)HCC-MSC在HCC細(xì)胞中新的lncRNA-MUF顯著增加。此外，lncRNA-MUF顯著促進(jìn)腫瘤發(fā)生和EMT特征。在機理上，lncRNA-MUF與ANXA2和miR-34a相互作用以參與EMT過程和腫瘤發(fā)生。總的來說，該研究的結(jié)果提供了一種新的機制，通過該機制，HCC-MSC促進(jìn)HCC進(jìn)展。

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