LncRNA-PAGBC acts as a microRNA sponge and promotes gallbladder tumorigenesis

LncRNA-PAGBC充當(dāng)microRNA海綿并促進(jìn)膽囊腫瘤發(fā)生

期刊：EMBO Reports；影響因子：8.749                

發(fā)表單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院    

     lncRNA可以通過(guò)ceRNA機(jī)制調(diào)控靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控通路變化影響細(xì)胞的增殖遷移等。本研究通過(guò)芯片篩選，基因共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-PAGBC是很重要的分子，生信預(yù)測(cè)其結(jié)合的microRNA位點(diǎn)，結(jié)合基因表達(dá)量變化，基因功能，及miRNA靶基因預(yù)測(cè)，找到SOX4和PIK3R3是ceRNA的靶基因。該靶基因參與AKT/mTOR通路，調(diào)控細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移。 

     長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）在許多癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中起作用；然而，lncRNAs在人類膽囊癌（GBC）的作用仍然很大程度上未知。在本研究中，我們?cè)谌祟?/span>GBC組織中鑒定了一組差異表達(dá)的lncRNA，包括預(yù)后相關(guān)的膽囊癌lncRNA（lncRNA-PAGBC），我們發(fā)現(xiàn)它們是GBC中的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。功能分析表明lncRNA-PAGBC促進(jìn)GBC細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。更重要的是，作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA），lncRNA-PAGBC競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合腫瘤抑制性microRNA miR-133b和miR-511。lncRNA-PAGBC的這種競(jìng)爭(zhēng)作用是其促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及激活AKT/mTOR途徑的能力所必需的。此外，lncRNA-PAGBC與多腺苷酸結(jié)合蛋白細(xì)胞質(zhì)1（PABPC1）相互作用，并通過(guò)這種相互作用穩(wěn)定。這項(xiàng)工作提供了GBC分子發(fā)病機(jī)制的新見解。   

     膽囊癌（GBC）是全球最常見的膽道癌和第六種最常見的胃腸道癌。由于其非特異性癥狀和高度侵入性，GBC通常在晚期被發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，來(lái)自不同機(jī)構(gòu)的研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）通過(guò)各種機(jī)制參與許多生理和病理過(guò)程，尤其是在不同癌癥的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中。因此，研究lncRNA在GBC中的作用可以幫助理解腫瘤發(fā)生和鑒定新的診斷和治療靶標(biāo)。

lncRNA以復(fù)雜的方式作為表觀遺傳調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄和翻譯的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子以時(shí)空方式。最近，已經(jīng)提出了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）的作用。在該模型中，lncRNA可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA反應(yīng)元件（MRE）來(lái)影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而影響其他mRNA或lncRNA轉(zhuǎn)錄物。  

結(jié) 果

     總共7,798個(gè)lncRNA和7,290個(gè)蛋白質(zhì)編碼RNA被鑒定為在9對(duì)GBC和非腫瘤樣品之間差異表達(dá)。分層聚類證明了GBC和配對(duì)的非腫瘤樣品之間的lncRNA和mRNA的表達(dá)水平的系統(tǒng)變化。在GBC中差異表達(dá)的前60個(gè)lncRNA和mRNA的熱圖顯示在圖1A中。為了驗(yàn)證微陣列結(jié)果的可靠性，四個(gè)隨機(jī)選擇的lncRNAs和lncRNA-MALAT1表達(dá)在腫瘤相應(yīng)的非腫瘤樣品進(jìn)行分析。結(jié)果證實(shí)BC010117，NR_038835和MALAT1在GBC樣品中高度表達(dá)，而AC240664.3和ENST00000415656在非腫瘤樣品中失調(diào)（圖1B）。

     使用基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)將各種轉(zhuǎn)錄物聚類成表型相關(guān)的共表達(dá)模塊。GBC和非腫瘤樣品的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)差異表明GBC和非腫瘤樣品中lncRNA和mRNA表達(dá)水平的變化?？紤]到生物學(xué)相關(guān)的基因在癌癥發(fā)展過(guò)程中傾向于顯示相似的變化模式，我們專注于具有高共表達(dá)蛋白質(zhì)編碼RNA的lncRNAs。lncRNA-PAGBC在GBC組織中高表達(dá)，與17個(gè)lncRNAs和30個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因相關(guān)，倍數(shù)變化≥10.0，P值≤0.05參與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

     對(duì)60對(duì)人GBC組織和相應(yīng)的非腫瘤組織進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果表明GBC組織中lncRNA-PAGBC轉(zhuǎn)錄水平顯著高于相應(yīng)的非腫瘤組織（圖1D）。77個(gè)人GBC組織中的lncRNA-PAGBC表達(dá)發(fā)現(xiàn)更高水平的lncRNA-PAGBC表達(dá)與更晚期的腫瘤階段相關(guān)。Kaplan-Meier分析表明具有較高lncRNA-PAGBC表達(dá)水平的GBC患者表現(xiàn)出顯著降低的總存活率（OS）（P <0.001，圖1E，上圖）。

     通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE）分析證實(shí)了lncRNA-PAGBC的全長(zhǎng)。熒光原位雜交和RT-PCR結(jié)果表明該lncRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1G和H）?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-PAGBC可能發(fā)揮GBC致癌作用。

     為了確定lncRNA-PAGBC在GBC細(xì)胞系中的生物學(xué)功能，我們穩(wěn)定地敲除了NOZ和GBC-SD細(xì)胞中的lncRNA-PAGBC。在lncRNA-PAGBC沉默后NOZ和GBC-SD細(xì)胞的增殖被顯著抑制。此外，使用皮下異種移植模型，結(jié)果表明，lncRNA-PAGBC耗盡的異種移植物的腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。另外，lncRNA-PAGBC的外源過(guò)表達(dá)在體外和體內(nèi)均促進(jìn)GBC細(xì)胞增殖和腫瘤形成。這些結(jié)果表明，lncRNA-PAGBC在體外和體內(nèi)均可調(diào)節(jié)GBC細(xì)胞增殖。

總之，這些數(shù)據(jù)顯示lncRNA-PAGBC促進(jìn)GBC細(xì)胞中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

     為了探索lncRNA-PAGBC是否可以作為ceRNA起作用，我們使用Segal Lab程序預(yù)測(cè)了lncRNA-PAGBC中可能的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示lncRNA-PAGBC含有近1,000個(gè)潛在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，表明lncRNA-PAGBC可能充當(dāng)ceRNA。根據(jù)該結(jié)果的指示和我們之前的GBC相關(guān)miRNA微陣列結(jié)果，我們進(jìn)一步縮小我們的結(jié)果miR-133b，miR-150，miR-511，miR-625，miR-765和miR-1258作為結(jié)合lncRNA-PAGBC的最可能的候選者。

     為了驗(yàn)證這些miRNA與lncRNA-PAGBC之間的結(jié)合，我們使用lncRNA-PAGBC的完整序列進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。miR-133b和miR-511的過(guò)表達(dá)降低了PAGBC報(bào)告載體的熒光素酶活性，但不降低空載體，而其他4種miRNA未能改變熒光素酶活性。為了驗(yàn)證這些miRNA與lncRNA-PAGBC在內(nèi)源性水平上的結(jié)合，使用MS2-RNA免疫沉淀來(lái)下拉與lncRNA-PAGBC相關(guān)的內(nèi)源性微RNA。PAGBC RIP在NOZ細(xì)胞中顯著富集miR-133b和miR-511?？傊?，這些結(jié)果表明lncRNA-PAGBC可以作為miR-133b和miR-511的ceRNA起作用。

     為了找到共享miR-133b和miR-511與PAGBC調(diào)節(jié)作用的基因，Targetscan預(yù)測(cè)了數(shù)百個(gè)靶基因考慮到微陣列數(shù)據(jù)中上調(diào)的基因，SOX4和PIK3R3引起了我們的注意，根據(jù)之前的研究，它們?cè)诟鞣N癌的腫瘤發(fā)生中起重要作用。以前的報(bào)道顯示miR-511-5p的表達(dá)需要宿主基因MRC1。進(jìn)行了熒光素酶測(cè)定，結(jié)果表明miR-133b和miR-511模擬物的轉(zhuǎn)染分別降低了SOX4和PIK3R3報(bào)告載體的熒光素酶活性，而突變沒(méi)有。

     作為ceRNA，lncRNA-PAGBC可與其靶標(biāo)共享調(diào)節(jié)miRNA；因此，我們假設(shè)lncRNA-PAGBC可以調(diào)節(jié)GBC細(xì)胞中的SOX4和PIK3R3。lncRNA-PAGBC過(guò)表達(dá)在EH-GB1細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)水平上調(diào)SOX4和PIK3R3，而異位表達(dá)的lncRNA-PAGBC-mut（miR-133b）或lncRNA-PAGBC-mut（miR-511）未顯著改變SOX4或PIK3R3表達(dá)。沉默NOZ細(xì)胞中的lncRNA-PAGBC在mRNA和蛋白質(zhì)水平下調(diào)SOX4和PIK3R3。對(duì)于拯救實(shí)驗(yàn)，miR-133b和miR-511在lncRNA-PAGBC沉默的NOZ細(xì)胞中被抑制。抑制miR-133b和miR-511分別增加了SOX4和PIK3R3的表達(dá)。相反，miR-133b和miR-511的過(guò)表達(dá)抵消了由EH-GB1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的lncRNA-PAGBC誘導(dǎo)的SOX4和PIK3R3表達(dá)的相應(yīng)增加。

     這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-PAGBC分別通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-133b和miR-511在調(diào)節(jié)SOX4和PIK3R3表達(dá)中起重要作用。

     miR-133b和miR-511可強(qiáng)烈抑制GBC細(xì)胞的增殖，集落形成和轉(zhuǎn)移能力。在以前的研究中，SOX4和PIK3R3都被證明可以促進(jìn)其他癌的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，這些研究表明SOX4和PIK3R3都參與AKT/mTOR通路，這對(duì)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。我們假設(shè)lncRNA-PAGBC激活GBC細(xì)胞中的AKT/mTOR途徑，并且這兩種miRNA都是PAGBC生物學(xué)功能所必需的。Western印跡分析證明lncRNA-PAGBC敲低抑制AKT和mTOR蛋白的磷酸化，而過(guò)表達(dá)促進(jìn)AKT和mTOR蛋白的磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明lncRNA-PAGBC激活GBC細(xì)胞中的AKT/mTOR途徑。接下來(lái)，進(jìn)行CCK-8和transwell測(cè)定以確定miR-133b和miR-511對(duì)GBC細(xì)胞中lncRNA-PAGBC功能的影響。結(jié)果顯示lncRNA-PAGBC過(guò)表達(dá)促進(jìn)了增殖和轉(zhuǎn)移。此外，我們抑制了lncRNA-PAGBC沉默的NOZ細(xì)胞中的miR-133b和miR-511，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA的抑制部分地抵消了由lncRNA-PAGBC敲低誘導(dǎo)的增殖和轉(zhuǎn)移的損害。相反，miR-133b和miR-511的過(guò)表達(dá)部分抵消了由lncRNA-PAGBC過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的增殖和轉(zhuǎn)移的增加。此外，miR-133b和miR-511的過(guò)表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了由lncRNA-PAGBC過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的AKT/mTOR途徑的激活。總之，這些數(shù)據(jù)表明，與miR-133b和miR-511的相互作用對(duì)于lncRNA-PAGBC在GBC細(xì)胞中促進(jìn)惡性和激活A(yù)KT/mTOR途徑是必需的。

     最近的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，許多lncRNA通過(guò)與蛋白質(zhì)的相互作用參與分子調(diào)控途徑。為了確定lncRNA-PAGBC是否以這種方式起作用，進(jìn)行RNA pull-down測(cè)定以鑒定與NOZ細(xì)胞中的lncRNA-PAGBC相關(guān)的蛋白質(zhì)。切下lncRNA-PAGBC特異性條帶并進(jìn)行質(zhì)譜分析。 Poly（A）結(jié)合蛋白，細(xì)胞質(zhì)1（PABPC1）是通過(guò)質(zhì)譜鑒定的主要蛋白質(zhì)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)Ago2被lncRNA-PAGBC富集，這進(jìn)一步支持了我們之前的Ago2 RIP結(jié)果。這些結(jié)果表明lncRNA-PAGBC與PABPC1蛋白相互作用。

     最近的幾項(xiàng)研究表明，PABPC1可以增加mRNA或長(zhǎng)鏈非編碼病毒RNA的穩(wěn)定性。另外，lncRNA-PAGBC具有Poly（A）尾，這是通常在mRNA中發(fā)現(xiàn)的特征。因此，我們假設(shè)PABPC1通過(guò)穩(wěn)定它來(lái)增加lncRNA-PAGBC的表達(dá)。為了驗(yàn)證該假設(shè)，在GBC細(xì)胞中siRNA敲低PABPC1后，進(jìn)行了lncRNA-PAGBC的qRT-PCR分析。結(jié)果顯示PABPC1沉默顯著降低了lncRNA-PAGBC的表達(dá)水平。為了檢查PABPC1是否調(diào)節(jié)lncRNA-PAGBC的穩(wěn)定性，我們用放線抑制劑放線菌素D處理NOZ細(xì)胞以阻斷新的RNA合成。然后我們?cè)?/span>12小時(shí)內(nèi)測(cè)量了lncRNA-PAGBC和GAPDH的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)PABPC1敲低顯著且快速地降低了lncRNA-PAGBC表達(dá)（圖7F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明PABPC1增加了lncRNA-PAGBC的穩(wěn)定性并通過(guò)與lncRNA-PAGBC結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)。此外，為了解PABPC1對(duì)lncRNA-PAGBC功能的作用，我們敲除了PABPC1在NOZ細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，PABPC1的沉默導(dǎo)致體外增殖和轉(zhuǎn)移的抑制，Akt/mTOR途徑的失活，miR-133b和miR-511的上調(diào)以及其靶基因的下調(diào)。在拯救實(shí)驗(yàn)中，lncRNA-PAGBC的過(guò)表達(dá)可以抵消PABPC1沉默的影響（圖EV4）。

     膽囊癌預(yù)后極差。我們對(duì)GBC中lncRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)lncRNA-PAGBC可作為不良預(yù)后標(biāo)記物應(yīng)用，并作為GBC中的致癌lncRNA。證明PABPC1與lncRNA-PAGBC相互作用并進(jìn)一步穩(wěn)定。更重要的是，lncRNA-PAGBC可通過(guò)作用于海綿來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生并激活GBC細(xì)胞中的AKT/mTOR途徑，從而損害miR-133b依賴性SOX4和miR-511依賴性PIK3R3下調(diào)（圖EV5）。我們的研究結(jié)果為GBC的分子發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，并提供了針對(duì)這種惡性腫瘤的潛在新型lncRNA指導(dǎo)的診斷和治療靶點(diǎn)。

其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀：lncRNA ceRNA機(jī)制怎么找分子

文獻(xiàn)解讀：Advanced Science：lnc, miRNA, mRNA關(guān)系一定是ceRNA嗎

文獻(xiàn)解讀：Nature?Cell Biology: lncRNA ceRNA調(diào)控胃癌EMT過(guò)程（IF:19.064）

文獻(xiàn)解讀：Nucleic Acids Res: lnc-RI ceRNA結(jié)合miR-193a-3p促進(jìn)DNA修復(fù)(IF: 11.561)

文獻(xiàn)解讀：Cancer Cell: lncARSR通過(guò)ceRNA調(diào)控腫瘤耐藥（IF: 22.844）

文獻(xiàn)解讀：胃癌lncRNA ceRNA機(jī)制研究

文獻(xiàn)解讀：這篇lncRNA ceRNA機(jī)制如何發(fā)到 IF12分的

文獻(xiàn)解讀：siRNA文庫(kù)技術(shù)篩選肝癌相關(guān)lncRNA