Taurine up‐regulated gene 1 functions as a master regulator to coordinate glycolysis and metastasis in hepatocellular carcinoma

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Taurine up‐regulated gene 1 functions as a master regulator to coordinate glycolysis and metastasis in hepatocellular carcinoma

?；撬嵘险{(diào)基因1作為主要調(diào)節(jié)劑起作用以協(xié)調(diào)肝細(xì)胞癌中的糖酵解和轉(zhuǎn)移

期刊：Hepatology；影響因子：14.079

發(fā)表單位：臺灣桃園長庚大學(xué)

導(dǎo) 讀

之前微文“Advanced Science：lnc, miRNA, mRNA關(guān)系一定是ceRNA嗎”介紹與lncRNA ceRNA機制相反，lncRNA可以穩(wěn)定miRNA的表達抑制靶基因。本研究同樣從lncRNA, miRNA, mRNA的角度闡釋了腫瘤樣品中lncRNA TUG1穩(wěn)定miR-455-3p抑制AMPKβ2表達，而AMPKβ2的抑制促進己糖激酶2（HK2）的表達，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)移和糖酵解。

摘要

癌細(xì)胞顯示出改變的葡萄糖代謝，其特征在于優(yōu)選有氧糖酵解。然而，糖酵解代謝是否影響HCC轉(zhuǎn)移的問題仍不清楚。在目前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)敲低?；撬嵘险{(diào)基因1（TUG1）可通過抑制miR-455-3p顯著抑制細(xì)胞遷移、侵襲和糖酵解。miR-455-3p直接靶向AMP激活的蛋白激酶亞基β2（AMPKβ2）的3'非翻譯區(qū)。TUG1/miR-455-3p/AMPKβ2軸通過調(diào)節(jié)己糖激酶2（HK2）調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，轉(zhuǎn)移和糖酵解。TUG1明顯與HCC患者的HK2過度表達和不良預(yù)后相關(guān)。

背景介紹

肝細(xì)胞癌（HCC）是世界上最常見的惡性肝腫瘤之一。HCC的長期預(yù)后仍然極差，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的主要根本原因。癌細(xì)胞的代謝特性不同于正常細(xì)胞的代謝特性。癌細(xì)胞表現(xiàn)出獨特的代謝表型，例如增強的葡萄糖攝取和丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。這種稱為Warburg效應(yīng)的現(xiàn)象賦予癌細(xì)胞相當(dāng)大的生長優(yōu)勢。除了依賴于糖酵解外，癌細(xì)胞還表現(xiàn)出非典型的代謝特征，例如脂肪酸合成增加和谷氨酰胺代謝增加。這些差異表明，靶向代謝依賴可能是治療癌癥患者的一種有前途的選擇性方法。

結(jié) 果

TUG1在HCC中高度表達

使用微陣列分析，在兩個HCC樣品中鑒定了與癌旁組織樣品相關(guān)的幾種差異表達的lncRNA（倍數(shù)變化≥2.0或≤0.5;P<0.05）。微陣列數(shù)據(jù)可在GEO上公開獲得，登錄號為GSE101679。在這些lncRNA中，123個持續(xù)上調(diào)，279個在HCC中持續(xù)下調(diào)。此外，進行qRT-PCR以驗證從微陣列分析獲得的基因表達結(jié)果，證實與相應(yīng)的非腫瘤對應(yīng)物相比，HCC組織中TUG1的顯著上調(diào)。將我們的數(shù)據(jù)中的基因表達數(shù)據(jù)與其他公開數(shù)據(jù)集聯(lián)系起來（數(shù)據(jù)2，GSE14520；數(shù)據(jù)3，GSE14323；數(shù)據(jù)4，癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)集TCGA）用于表達模式的生物學(xué)解釋。一致地，TUG1在來自其他數(shù)據(jù)的HCC中高度表達。如何挖掘TCGA，GEO等數(shù)據(jù)參考微文“重磅首發(fā): TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA數(shù)據(jù)挖掘（含分析結(jié)果）”

TUG1的沉默抑制HCC細(xì)胞遷移，侵襲，轉(zhuǎn)移和糖酵解

大多數(shù)lncRNA的確切功能尚未確定。以前的研究表明，具有相似共表達模式的基因傾向于表現(xiàn)出功能連貫性。這種方法可以有效地用于探索lncRNA在癌癥進展中的作用。在目前的研究中，TUG1的共表達分析在公開數(shù)據(jù)集（GSE14323）中使用Pearson相關(guān)性進行，然后在排序列表中排序Pearson相關(guān)系數(shù)。將數(shù)據(jù)上載至基因組富集分析工具，并使用“Gene Set Enrichment Analysis Preranked”模塊進行通路分析。結(jié)果表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化顯著增強并且與TUG1表達正相關(guān)。此外，細(xì)胞周期和糖酵解表型與TUG1正相關(guān)，正如使用生物信息學(xué)工具lncRNAtor所觀察到的那樣，清楚地表明TUG1參與了這些通路。

與體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染載體對照的細(xì)胞相比，敲低TUG1顯著抑制Hep3B和SK-Hep1細(xì)胞系的生長。使用qRT-PCR進一步證實腫瘤中的TUG1表達。之前已經(jīng)報道過這些表型。另外還研究了TUG1對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的潛在影響。在沉默內(nèi)源性TUG1的Hep3B和SK-Hep1細(xì)胞中明顯抑制了遷移和侵襲能力（圖1A，B）。代謝重編程是細(xì)胞轉(zhuǎn)化的已知標(biāo)志，但對腫瘤轉(zhuǎn)移伴隨的代謝變化知之甚少。為了探索TUG1對肝癌細(xì)胞代謝重編程的潛在影響，評估了葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生。值得注意的是，TUG1的敲低降低了Hep3B細(xì)胞的葡萄糖攝取能力并導(dǎo)致乳酸產(chǎn)生減少。為了進一步驗證TUG1對HCC糖酵解的影響，使用XF24細(xì)胞外通量分析儀測量細(xì)胞外酸化率。數(shù)據(jù)一致表明，敲低TUG1顯著抑制Hep3B細(xì)胞中的糖酵解速率。

miR-455-3p由TUG1上調(diào)

已經(jīng)報道了lncRNA對miRNA表達的影響。為了鑒定TUG1調(diào)節(jié)的miRNA，使用qRT-PCR在TUG1沉默的Hep3B細(xì)胞系中進行miRNA表達篩選。因此，miR-455-3p被確定為新的潛在候選者。我們的qRT-PCR結(jié)果顯示在TUG1沉默的Hep3B細(xì)胞系中成熟miR-455-3p的下調(diào)。此外，miR-455的前體和初級轉(zhuǎn)錄物受TUG1顯著調(diào)節(jié)，表明miR-455-3p在轉(zhuǎn)錄水平被TUG1調(diào)節(jié)。接下來，檢查miR-455-3p對細(xì)胞生長，遷移，侵襲和糖酵解的影響。miR-455-3p的敲低導(dǎo)致遷移，侵襲，糖酵解和細(xì)胞增殖減少，類似于由TUG1抑制誘導(dǎo)的表型。相反，miR-455-3p的過表達導(dǎo)致相反的效果。

AMPKβ是miR-455-3p的目標(biāo)

為了探索TUG1/miR-455-3p軸的直接作用，選擇miR-455-3p的特異性靶基因用于進一步研究。使用TargetScan和miRDB軟件進行的搜索，AMPKβ2被鑒定為潛在的miR-455-3p靶基因。進行熒光素酶報告基因測定強烈暗示AMPKβ2是直接miR-455-3p靶標(biāo)。通過產(chǎn)生穩(wěn)定敲低AMPKβ2的Hep3B和SK-Hep1細(xì)胞，進一步檢測AMPKβ2對細(xì)胞遷移和侵襲的影響。值得注意的是，AMPKβ2敲低導(dǎo)致細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強，而其過表達則產(chǎn)生相反的效果。

TUG1調(diào)節(jié)mTOR/AMPKα 通路的目標(biāo)以及HK2，AMPKβ2和SNAIL表達

AMPKα通過抑制各種癌癥（包括HCC）中的糖酵解和腫瘤生長而起到抑制腫瘤的作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是腫瘤相關(guān)上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)特征的過程，是轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟。評估TUG1是否有助于這些腫瘤標(biāo)志物的活性，檢測了p-AMPKα（Thr172）和Snail的蛋白質(zhì)水平。TUG1敲低細(xì)胞中間充質(zhì)標(biāo)記物Snail的水平降低。TUG1敲低的Hep3B或SK-Hep1細(xì)胞中p-AMPKα（Thr172）的水平更高，但總蛋白水平不是。TUG1敲低的細(xì)胞中AMPKβ2蛋白水平增加。用miR-455-3p敲低細(xì)胞觀察到類似的結(jié)果。為了確定miR-455-3p，AMPKβ2或AMPKα可能參與TUG1介導(dǎo)的細(xì)胞生長和遷移能力，建立了過表達miR-455-3p或沉默AMPKβ2或AMPKα1的TUG1敲低細(xì)胞。值得注意的是，TUG1敲低細(xì)胞中miR-455-3p過表達誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和遷移的顯著增加。敲除AMPKβ2或AMPKα逆轉(zhuǎn)了TUG1敲低對細(xì)胞遷移和生長的影響，表明TUG1通過調(diào)節(jié)miR-455-3p，AMPKβ2和AMPKα發(fā)揮其致癌作用。與TUG1敲低細(xì)胞相比，TUG1和AMPKβ2敲低細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平明顯增加。

HK2 泛素化和降解由TUG1/miR-455-3p 監(jiān)管

HK2 mRNA僅在TUG1敲低細(xì)胞系中被輕微抑制，表明HK2表達在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平受TUG1調(diào)節(jié)。進一步研究了HK2的基本調(diào)控機制。有趣的是，HK2的表達通過TUG1或miR-455-3p敲低細(xì)胞中的蛋白酶體抑制劑MG132穩(wěn)定，暗示TUG1或miR-455-3p直接通過蛋白酶體控制HK2蛋白穩(wěn)定性。此外，與環(huán)己酰亞胺追蹤實驗中的對照（sh-luc）細(xì)胞相比，在TUG1敲低中HK2周轉(zhuǎn)率是快速的。

高度轉(zhuǎn)移的HCC細(xì)胞系顯示高度的糖化能力

為了進一步確定癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與糖酵解表型的關(guān)聯(lián)，使用體外transwell侵襲測定建立高度轉(zhuǎn)移的Hep3B衍生的細(xì)胞群（稱為Hep3B-TW）。Hep3B-TW的侵襲能力高于Hep3B。如所預(yù)期的，相對于Hep3B細(xì)胞，Hep3B-TW中miR-455-3p表達增加。相對于親本Hep3B細(xì)胞，p-AMPKα（Thr172）和AMPKβ2蛋白水平較低。此外，與Hep3B細(xì)胞相比，Hep3B-TW細(xì)胞中的糖酵解速率升高。

TUG1與HK2的臨床相關(guān)性

為了確定HK2，p-mTOR（Ser2448），p-AMPKα（Thr172），AMPK2和miR-455-3p表達水平是否與腫瘤進展相關(guān)，分別在HCC標(biāo)本中進行蛋白質(zhì)印跡和qRT-PCR測量蛋白質(zhì)和RNA水平。相對于相應(yīng)的非腫瘤對應(yīng)物，HK2在HCC組織中高度表達，而在HCC中p-AMPKα（Thr172）和AMPKβ2水平下調(diào)。在HCC中MiR-455-3p表達升高。顯示增強的HK2和p-mTOR（Ser2448）表達并伴隨降低的p-AMPKα（Thr172）。Spearman相關(guān)系數(shù)分析的結(jié)果證實TUG1與miR-455-3p和HK2顯著正相關(guān)?？紤]到HCC腫瘤中TUG1和HK2之間的正相關(guān)性。臨床研究驗證了TUG1/miR-455-3p/AMPKβ2/HK2在體內(nèi)和體外的相關(guān)性，明確支持TUG1，miR-455-3p，AMPKβ2和HK2在肝細(xì)胞瘤中的關(guān)鍵病理學(xué)作用。

結(jié) 論

總之，我們已經(jīng)取得了概念上的進展，支持改變糖酵解代謝有助于轉(zhuǎn)移表型的理論。TUG1通過上調(diào)EED表達降低p21表達，并導(dǎo)致p21-E2F1相互作用減少和miR-455-3p表達增強。因此，miR-455-3p抑制AMPKβ2表達并促進HK2和Snail表達增加。我們已經(jīng)鑒定了一種通路，其互連TUG1，miR-455-3p，AMPKβ2，AMPKα/mTOR，Snail和HK2，其調(diào)節(jié)肝細(xì)胞瘤的糖酵解，運動和侵襲。我們的研究提供了靶向TUG1和HK2用于治療HCC的潛在治療策略。