Recently Evolved Tumor Suppressor Transcript TP73-AS1 Functions as Sponge of Human-Specific miR-941

最近進(jìn)化的腫瘤抑制因子轉(zhuǎn)錄本TP73-AS1作為人特異性miR-941的海綿起作用

期刊：Molecular Biologyand Evolution；影響因子：10.217 

發(fā)表單位：中國藥科大學(xué)  

    已知miRNA，如何尋找結(jié)合的miRNA海綿lncRNA，本研究確定miR-941，使用targetscan軟件掃描可以與之結(jié)合的lncRNA，或circRNA。發(fā)現(xiàn)TP73-AS1有9個結(jié)合位點，從多物種進(jìn)化的角度討論了，TP73-AS1與miR-941進(jìn)化保守性，結(jié)合保守性。詳細(xì)論述了TP73-AS1與miR-941結(jié)合位點。對于尋找ceRNA中miRNA和lncRNA很有參考意義。

    miRNA海綿是轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的重要組成部分。然而，僅鑒定了有限數(shù)量的miRNA海綿。在這里，我們顯示最近進(jìn)化的非編碼腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄本，TP73基因的反義RNA（TP73-AS1），作為人特異性miRNA miR-941的天然海綿。我們發(fā)現(xiàn)9個異常高親和力的miR-941結(jié)合位點聚集在TP73-AS1的1kb區(qū)域內(nèi)，形成miR-941海綿區(qū)域。我們基于大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，傷口愈合測定和在細(xì)胞系中進(jìn)行的Argonaute蛋白免疫沉淀實驗進(jìn)一步確認(rèn)TP73-AS1作為有效的miR-941海綿起作用。

    miRNA是廣泛認(rèn)可的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，可以微調(diào)大多數(shù)哺乳動物蛋白編碼基因（PCG）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)。miRNA的主要功能是將RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）引導(dǎo)至含有轉(zhuǎn)錄本的互補(bǔ)結(jié)合位點。雖然已經(jīng)描述了含有單個miRNA結(jié)合位點的miRNA海綿，但是大多數(shù)有效的miRNA海綿轉(zhuǎn)錄本含有多個高親和力miRNA結(jié)合位點并且以高水平表達(dá)。目前，分別在人和小鼠中記錄了具有實驗證據(jù)的64和117個miRNA海綿轉(zhuǎn)錄本。實例包括最近進(jìn)化的假基因PTENP1，lncRNA slinc-RoR和靈長類特異性的lncND，以及脊椎動物物種中保守的轉(zhuǎn)錄本：環(huán)狀RNA（circRNA）CDR1as和sryRNA。

    為了鑒定潛在的miR-941-海綿基因，我們篩選了人非編碼轉(zhuǎn)錄本（NCT），包括36,687個線性轉(zhuǎn)錄本和36,019個circRNA。為此，我們使用來自本研究生成的四個人類前額皮質(zhì)（PFC）樣本的Ribo-minus測序數(shù)據(jù)編輯已知的線性NCT并鑒定潛在的circRNA，并重新分析54個公布的Ribo-minus測序數(shù)據(jù)集。我們使用TargetScan鑒定了存在于NCT內(nèi)的miR-941結(jié)合位點，沒有位點保守要求。2,050個（2.8％）含有一個結(jié)合位點。值得注意的是，注釋為TP73基因的反義RNA的線性轉(zhuǎn)錄本（TP73-AS1，也稱為KIAA0495或PDAM）含有9個miR-941結(jié)合位點（圖1a，補(bǔ)充表S2，在線補(bǔ)充材料）。

    在TP73-AS1中，9個miR-941結(jié)合位點不是均勻分布的，而是聚集在~900-nt長區(qū)域內(nèi)，形成miR-941海綿區(qū)域（圖1b）。9個結(jié)合位點中的每一個包含與miR-941的5'末端2-10位的完全互補(bǔ)的9-nt長區(qū)域（圖1c）?？傊?，這些序列特征導(dǎo)致TP73-AS1與其他miR-941靶基因相比具有顯著更高的結(jié)合親和力（Wilcoxon秩和檢驗，P<0.01，補(bǔ)充圖S3），進(jìn)一步表明TP73-AS1轉(zhuǎn)錄本代表天然存在的miR-941海綿。

    TP73-AS1轉(zhuǎn)錄本中miR-941結(jié)合位點的出現(xiàn)先于miR-941的進(jìn)化。含有直接或反向構(gòu)型的miR-941結(jié)合位點的串聯(lián)重復(fù)序列（miR-941結(jié)合位點的反向互補(bǔ)）存在于人，猿和OWM中TP73-AS1的特定區(qū)域內(nèi)（圖2a）。OWM，如獼猴和狒狒，分別有一個和兩個miR-941結(jié)合位點，猩猩有六個，大猩猩有12個，黑猩猩有16個，人類有9個。人類和猿譜系miR-941結(jié)合位點數(shù)的增加可以追溯到在OWM中含有單個miR-941結(jié)合位點的71-nt長序列的串聯(lián)擴(kuò)增（圖2a和b）。

    值得注意的是，包含所有miR-941結(jié)合位點的TP73-AS1的“海綿”部分的1-kb長基因組區(qū)域僅在人類中顯示出增加的序列保守性。具體而言，對區(qū)域內(nèi)和側(cè)翼1-kb長序列中的常見單核苷酸多態(tài)性（SNP）的分析顯示人類中SNP發(fā)生的明顯減少，但在黑猩猩和獼猴中沒有（圖2c）。

    在人類基因組中，TP73-AS1注釋為位于chr1的p36.32區(qū)域中的兩個PCG，TP73和CCDC27之間的6,409-nt-lncRNA（圖3a）。TP73-AS1與尾部到尾部配置的TP73重疊，重疊長度為216nt。雖然TP73和CCDC27在哺乳動物中都是保守的，但人類TP73-AS1的序列直向同源物可以在猿，OWM和新世界猴（NWMs）中鑒定，但在小鼠，大鼠，牛和雞中不能鑒定（圖3a）。這意味著TP73-AS1的轉(zhuǎn)錄僅限于人，猿和OWM。盡管TP73-AS1是最近進(jìn)化的lncRNA，但它在63個人組織中普遍存在且高度表達(dá)。此外，TP73-AS1表達(dá)平均比其鄰近基因TP73和CCDC27的表達(dá)高50倍。

    由于miRNA的抑制功能，其表達(dá)通常與線性海綿轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。為了評估miR-941和TP73-AS1的情況，我們進(jìn)行了細(xì)胞系轉(zhuǎn)染和免疫沉淀實驗，并分析了現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。TP73-AS1是miR-941的預(yù)測靶標(biāo)之一。為了驗證這一點，我們用miR-941雙鏈體或模擬對照一式三份轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，并使用RNA-seq評估TP73-AS1表達(dá)。與模擬物相比，miR-941雙鏈體轉(zhuǎn)染后24小時TP73-AS1表達(dá)顯著降低。因此，在各種人細(xì)胞系中，miR-941一致地負(fù)調(diào)節(jié)TP73-AS1的表達(dá)。類似地，表達(dá)miR-941和TP73-AS1轉(zhuǎn)錄本在11種類型的人免疫細(xì)胞中反向相關(guān)（Pearson相關(guān)性r=-0.74，P<0.01）。

    為了評估TP73-AS1是否與RISC中的miR-941物理相互作用，我們在用miR-941雙鏈體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞系中進(jìn)行了AGO2免疫沉淀（AGO2-IP）實驗?；谖㈥嚵械?/span>IP產(chǎn)物分析表明，與TP73-AS1特異性的所有三種微陣列探針的IgG對照相比，AGO2復(fù)合物中TP73-AS1的濃度一致，表明TP73-AS1和miR-941的直接相互作用。RISC?？傊鲜鼋Y(jié)果強(qiáng)烈表明TP73-AS1是miR-941的真實靶標(biāo)。

    miR-941的過表達(dá)顯示出對肝細(xì)胞，結(jié)腸直腸癌和胃癌細(xì)胞中細(xì)胞遷移的顯著抑制。我們對基于實驗驗證的miR-941靶標(biāo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的分析同樣挑選出一個網(wǎng)絡(luò)模塊，該網(wǎng)絡(luò)模塊使用CoCiter顯著富集與“細(xì)胞遷移”術(shù)語相關(guān)的基因。為了評估TP73-AS1是否可以阻斷miR-941對細(xì)胞遷移的抑制，我們進(jìn)行了miR-941和TP73-AS1過表達(dá)實驗，隨后在293T細(xì)胞中進(jìn)行了傷口愈合測定。與先前的研究一致，用攜帶含有7種miR-941前體的人miR-941簇區(qū)的載體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞可重復(fù)地抑制細(xì)胞遷移。相反，用miR-941載體和攜帶含有9個miR-941結(jié)合位點（TP73-AS1海綿區(qū)域）的人TP73-AS1區(qū)域的載體的平行轉(zhuǎn)染消除了抑制，并導(dǎo)致加速的細(xì)胞遷移。

    以前的研究表明TP73-AS1可作為腫瘤抑制因子起作用，而miR-941優(yōu)先在增殖和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)TP73-AS1和miR-941在15種健康人體組織和8種人類癌細(xì)胞系中具有驚人相反的表達(dá)模式：miR-941在腫瘤中表達(dá)高出約8倍，TP73-AS1在正常組織中表達(dá)高出4倍。在健康組織中。類似地，我們發(fā)現(xiàn)使用包含63個健康組織和675個癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)集在健康組織中TP73-AS1的表達(dá)升高，以及調(diào)查87個健康組織和287個原發(fā)性腫瘤的微陣列數(shù)據(jù)集。

    在許多癌癥中觀察到TP73-AS1的表達(dá)抑制，包括黑素瘤，可能是由于啟動子區(qū)域的DNA高甲基化。我們的結(jié)果表明，這可能導(dǎo)致miR-941上調(diào)。為了測試這一點，我們檢測了miR-941及其在正常黑素細(xì)胞向黑素瘤轉(zhuǎn)化過程中的靶基因表達(dá)變化。我們發(fā)現(xiàn)，雖然TP73-AS1下降，但miR-941的表達(dá)確實從黑素細(xì)胞增加到黑素細(xì)胞的2倍以上。因此，miR-941靶基因的表達(dá)在黑素瘤中被顯著抑制。此外，TP73-AS1表達(dá)與82個原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞系中miR-941靶基因的表達(dá)正相關(guān)。值得注意的是，在miR-941靶標(biāo)中，TSG顯示出更強(qiáng)的相關(guān)性，包括已知的TSGTP73，TP73-AS1的反義基因。

    我們對來自9種不同組織類型的大量MCTP癌癥樣品的分析產(chǎn)生了類似的結(jié)果。因此，影響多個TSG表達(dá)水平的miR-941和TP73-AS1表達(dá)之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)可能表明轉(zhuǎn)錄本在腫瘤發(fā)生和腫瘤抑制中的作用的重要性。

    總之，這些觀察結(jié)果使我們能夠提出TP73-AS1和miR-941進(jìn)化的可能情景。TP73-AS1在大約4千萬年前出現(xiàn)后表達(dá)的快速上升可能是由于其腫瘤抑制功能為表達(dá)它的個體提供了適應(yīng)性益處。反過來，miR-941在過去600萬年出現(xiàn)后表達(dá)的快速上升可能是由TP73-AS1作為miR-941海綿起作用的，因此減少了新調(diào)節(jié)劑的潛在有害作用。然而，miR-941似乎充當(dāng)TP73-AS1拮抗劑并且可以代表有效的腫瘤發(fā)生因子。miR-941的這種明顯有害的功能必須被其提供給其攜帶者的適應(yīng)性優(yōu)勢所抵消，這可能與發(fā)育期間的細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)有關(guān)。如果這些觀點是正確的，進(jìn)化新型TP73-AS1和miR-941轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié)平衡可能在人體組織的腫瘤發(fā)生中起重要作用。此外，在基于除人類以外的物種的模型系統(tǒng)中，這種角色將被遺漏。

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