Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion

非編碼RNA通過(guò)ceRNA介導(dǎo)的miRNA逃避參與CLDN4的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)

期刊：NATURE COMMUNICATIONS；影響因子：12.353

發(fā)表單位：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院                                            

    大多老師通過(guò)芯片或者測(cè)序獲得了差異表達(dá)的lncRNA，此時(shí)想研究其ceRNA機(jī)制。一般邏輯是找到差異lncRNA，接下來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)合的miRNA，再預(yù)測(cè)miRNA結(jié)合的靶基因?？墒腔蛟S會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)lncRNA在本研究中確是發(fā)揮重要作用嗎?如果驗(yàn)證了差異lnc，也可能找不到合適的miRNA及有效的靶基因。lncRNA與miRNA是調(diào)節(jié)分子，其作用依賴于靶基因的功能。正常找分子的思路應(yīng)該是先找到有效的靶基因（該基因在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用，他的變化，會(huì)影響整個(gè)過(guò)程），而后預(yù)測(cè)可以結(jié)合并抑制他的miRNA，進(jìn)而倒推哪些lncRNA可以結(jié)合miRNA。本研究是一個(gè)很好的例子。                                                                         

    本研究，我們發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)節(jié)胃癌中Claudin-4的網(wǎng)絡(luò)。我們觀察到Claudin-4在胃癌中上調(diào)并且與預(yù)后不良有關(guān)。Claudin-4可增強(qiáng)AGS，HGC-27和SGC-7901細(xì)胞的增殖，侵襲和EMT，這可被miR-596和miR-3620-3p逆轉(zhuǎn)。此外，lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA來(lái)影響Claudin-4的功能。我們的結(jié)果表明，非編碼RNA在Claudin-4的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。                                            

    胃癌（GC）是最常見(jiàn)的癌癥之一，在世界范圍內(nèi)死亡率很高。轉(zhuǎn)移是許多復(fù)雜過(guò)程的最終結(jié)果，是臨床實(shí)踐中的一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。越來(lái)越多的證據(jù)揭示了miRNA在癌基因和腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中不可或缺的功能，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，如侵襲，轉(zhuǎn)移，增殖和凋亡。有趣的是，最近的一些研究報(bào)告了一種全新的lncRNAs調(diào)控通路，其中lncRNA可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）發(fā)揮作用，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其常見(jiàn)的miRNA與mRNA發(fā)生串?dāng)_。                                                     

    為了鑒定GC中mRNA和ncRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，使用Human LncRNA+mRNA Arrayv3.0以及miRCURY LNATM microRNA Array通過(guò)微陣列分析六對(duì)GC組織和癌旁組織?？偣舶l(fā)現(xiàn)235個(gè)miRNA在GC和非腫瘤鄰近組織之間差異表達(dá)，包括173個(gè)上調(diào)，62個(gè)下調(diào)超過(guò)2倍。共發(fā)現(xiàn)4329個(gè)lncRNA顯著差異表達(dá)，其中1974個(gè)上調(diào)，2355個(gè)下調(diào)?？偣茶b定了3369個(gè)差異表達(dá)的mRNA，其中1816個(gè)上調(diào)，1553個(gè)下調(diào)超過(guò)2倍。應(yīng)用分層聚類以顯示miRNA，lncRNA和mRNA的表達(dá)模式（圖1a）。根據(jù)通路分析結(jié)果，我們選擇了四種與癌癥發(fā)展相關(guān)的經(jīng)典通路：“細(xì)胞粘附”，“癌癥中的通路”，“緊密連接”和“細(xì)胞周期”。結(jié)合lncRNA和miRNA微陣列結(jié)果，在選擇這四種通路中的經(jīng)典基因時(shí)進(jìn)行mRNA-ceRNA分析（圖1b）。

    在“緊密連接”通路的mRNA-ceRNA分析結(jié)果中，與癌癥發(fā)展密切相關(guān)的CLDN4引起了我們的注意。最初，TargetScan（7.1版）結(jié)果顯示CLDN4含有預(yù)測(cè)的miR-596，miR-3620-3p和miR-4292靶向位點(diǎn)（圖1c）。我們證實(shí)了miR-596，miR-3620-3p和miR-4292在轉(zhuǎn)錄（圖1d）和翻譯（圖1e）水平上可以對(duì)CLDN4表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控。為了測(cè)試這些miRNA對(duì)基因表達(dá)的影響，我們將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒psiCHECK2-CLDN4轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞中。過(guò)表達(dá)miR-596和miR-3620-3p，但不是miR-4292，miR-596-mut，miR-3620-3p-mut，miR-4292-mut或miRNA陰性對(duì)照（miR-NC），降低了psiCHECK2-CLDN4的熒光素酶活性。證明CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的靶基因。

    為了測(cè)試CLDN4的生物學(xué)功能并進(jìn)一步驗(yàn)證其與miR-596和miR-3620-3p的結(jié)合，我們?cè)?span style="margin:0px;padding:0px;">SGC-7901，AGS和HGC-27細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CLDN4。通過(guò)miR-596或miR-3620-3p的異位過(guò)表達(dá)，可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上克服由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染引起的CLDN4上調(diào)。通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)與含有空載體pEX-2的平行穩(wěn)定細(xì)胞系相比，CLDN4過(guò)表達(dá)可顯著提高SGC-7901，AGS和HGC-27細(xì)胞的增殖能力（pEX2-NC細(xì)胞）。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-596或miR-3620-3p而非miR-596-mut或miR-3620-3p-mut時(shí)，可以消除這種增加。CLDN4過(guò)表達(dá)可以顯著提高GC細(xì)胞的侵襲能力，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-596或miR-3620-3p時(shí)，這種增加可以再次部分消除。CCK-8測(cè)定顯示CLDN4敲低細(xì)胞的增殖明顯慢于用亂序shRNA轉(zhuǎn)染的平行穩(wěn)定細(xì)胞系。與LV3-sh-NC細(xì)胞相比，LV3-sh-CLDN4細(xì)胞也顯示出減弱的侵襲能力。通過(guò)抑制miR-596或miR-3620-3p可以在很大程度上挽救由敲除CLDN4引起的增殖能力和侵襲能力的降低。

    我們注意到CLDN4對(duì)細(xì)胞周期分布或細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯影響。令我們驚訝的是，miR-596或miR-3620-3p可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這表明miRNA的其他靶基因可能有助于這一有趣的結(jié)果。然后，為了評(píng)估這兩種miRNA對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響是否主要依賴于CLDN4，我們將兩種miRNA轉(zhuǎn)染到CLDN4敲低細(xì)胞中。當(dāng)CLDN4被敲低時(shí)，兩種miRNA對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移幾乎沒(méi)有影響。

    我們看到，與pEX2-NC細(xì)胞相比，CLDN4的過(guò)表達(dá)可以降低E-鈣粘蛋白和細(xì)胞角蛋白的表達(dá)，并增強(qiáng)N-鈣粘蛋白，β-連環(huán)蛋白，Twist1，ZEB-2和MMP9的表達(dá)。正如預(yù)期的那樣，miR-596和miR-3620-3p可以部分消除這些影響。

    為了進(jìn)一步研究CLDN4在人類GC中的作用，我們?cè)?span style="margin:0px;padding:0px;">104對(duì)GC組織和癌旁組織中進(jìn)行了深度驗(yàn)證。GC組織中CLDN4的轉(zhuǎn)錄水平顯著更高。對(duì)這104名患者使用Kaplan-Meier分析和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)較高的CLDN4表達(dá)水平與總體存活率降低顯著相關(guān)。此外，Cox多變量分析的結(jié)果顯示，較高的CLDN4表達(dá)是GC預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。由于CLDN4已被證明是miR-596和miR-3620-3p的靶基因，我們還檢測(cè)了這些miRNA在相同組織中的表達(dá)。miR-596和miR-3620-3p的表達(dá)水平在GC組織中均顯著較低。這些數(shù)據(jù)支持GC組織中高CLDN4表達(dá)與較差的存活相關(guān)并且與miR-596和miR-3620-3p的表達(dá)負(fù)相關(guān)。

    為了鑒定可能與miR-596或miR-3620-3p相互作用并充當(dāng)ceRNA的lncRNA，我們進(jìn)行了關(guān)注前面提到的“緊密連接”網(wǎng)絡(luò)的實(shí)驗(yàn)。在14種候選lncRNA中，lncRNA-KRTAP5-AS1在響應(yīng)miR-596的過(guò)表達(dá)時(shí)呈現(xiàn)最明顯的下調(diào)。同時(shí)，lncRNA-TUBB2A和lncRNA-KRTAP5-AS1的表達(dá)在miR-3620-3p過(guò)表達(dá)后降低最多。為了測(cè)試這些調(diào)節(jié)相互作用的特異性，我們對(duì)6種胃癌細(xì)胞系進(jìn)行了RNA測(cè)序（過(guò)表達(dá)miR-596的SGC-7901細(xì)胞，過(guò)表達(dá)miR-3620-3p，miRNA陰性對(duì)照，過(guò)表達(dá)lncRNA-KRTAP5-AS1，過(guò)表達(dá)lncRNA-TUBB2A，或lncRNA陰性對(duì)照）。在過(guò)表達(dá)miR-596的細(xì)胞中，CLDN4的表達(dá)（FPKM的倍數(shù)變化=0.125）和lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍數(shù)變化=0.760）被下調(diào)。此外，CLDN4的表達(dá)（FPKM的倍數(shù)變化=0.543），lncRNA-TUBB2A（FPKM的倍數(shù)變化=0.854）和lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍數(shù)變化=0.280）均下調(diào)在與對(duì)照組相比過(guò)表達(dá)miR-3620-3p的細(xì)胞中。有趣的是，在過(guò)表達(dá)lncRNA-KRTAP5-AS1（FPKM的倍數(shù)變化=14.168）或lncRNA-TUBB2A（FPKM的倍數(shù)變化=12.051）的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CLDN4表達(dá)增加。

    LncRNA-KRTAP5-AS1位于11號(hào)染色體上，長(zhǎng)度為2554個(gè)核苷酸，具有5個(gè)預(yù)測(cè)的miR-3620-3p靶向位點(diǎn)和5個(gè)預(yù)測(cè)的miR-596靶向位點(diǎn)。LncRNA-TUBB2A位于染色體6上，長(zhǎng)度為1052個(gè)核苷酸，具有5個(gè)預(yù)測(cè)的miR-3620-3p靶向位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A通過(guò)ISH呈現(xiàn)與CLDN4和miRNA相同的細(xì)胞質(zhì)定位。熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示miR-596和miR-3620-3p數(shù)據(jù)顯示lncRNA-KRTAP5-AS1可以結(jié)合miR-596和miR-3620-3p。同時(shí)，lncRNA-TUBB2A可以結(jié)合miR-3620-3p。

    為了測(cè)試這兩種lncRNA的生物學(xué)功能，我們?cè)?span style="margin:0px;padding:0px;">GC癌細(xì)胞中進(jìn)行了功能獲得和功能喪失研究。我們?cè)?span style="margin:0px;padding:0px;">SGC-7901，AGS和HGC-27細(xì)胞中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或敲低了lncRNA-KRTAP5-AS1。通過(guò)CCK-8測(cè)定法測(cè)量，LncRNA-KRTAP5-AS1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致增殖能力增加。毫不奇怪，miR-596和miR-3620-3p可以消除由lncRNA-KRTAP5-AS1引起的兩種生物學(xué)功能。相反，內(nèi)源性lncRNA-KRTAP5-AS1表達(dá)的敲低顯著降低了AGS細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力。如所預(yù)期的，miR-596或miR-3620-3p的抑制可以再次降低這些效應(yīng)。

    進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)以通過(guò)在SGC-7901，AGS和HGC-27細(xì)胞中的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和抑制來(lái)測(cè)試lncRNA-TUBB2A的生物學(xué)功能。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)CCK-8和transwell實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)lncRNA-TUBB2A過(guò)表達(dá)增加了GC細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力，miR-3620-3p可以部分消除這種作用。相反，抑制miR-3620-3p可以挽救由lncRNA-TUBB2A敲低引起的增殖能力和侵襲能力的降低。

    miR-596和miR-3620-3p可以消除CLDN4促進(jìn)體外細(xì)胞增殖和侵襲的能力，并且CLDN4細(xì)胞中lncRNA-KRTAP5-AS1或lncRNA-TUBB2A的過(guò)表達(dá)顯著進(jìn)一步提高了這些能力。隨后，測(cè)量這兩種lncRNA的EMT誘導(dǎo)效應(yīng)。在lncRNA過(guò)表達(dá)后，上調(diào)標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白，細(xì)胞角蛋白）的下調(diào)和由CLDN4誘導(dǎo)的間充質(zhì)標(biāo)志物和入侵相關(guān)標(biāo)志物（N-鈣粘蛋白，ZEB-2，MMP9）的上調(diào)被夸大?？傊覀儼l(fā)現(xiàn)通過(guò)作為ceRNA調(diào)節(jié)CLDN4表達(dá)，lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲和EMT。LncRNA-KRTAP5-AS1似乎充當(dāng)miR-596和miR-3620-3p的ceRNA，而lncRNA-TUBB2A充當(dāng)miR-3620-3p的ceRNA。

    為了評(píng)估這些基因在體內(nèi)的生物學(xué)功能，將不同的SGC-7901或HGC-27細(xì)胞皮下或靜脈內(nèi)注射到裸鼠中?？偣灿辛M：第1組（pEX2-NC）注射pEX2-NC細(xì)胞;第2組（CLDN4）注射過(guò)量表達(dá)CLDN4的細(xì)胞;第3組（miR-596+CLDN4）注射用miR-596模擬物轉(zhuǎn)染的過(guò)表達(dá)CLDN4的細(xì)胞;第4組（miR-3620-3p+CLDN4）注射用miR-3620-3p模擬物轉(zhuǎn)染的CLDN4過(guò)表達(dá)細(xì)胞;第5組（lncRNA-KRTAP5-AS1+CLDN4）注射用lncRNA-KRTAP5-AS1轉(zhuǎn)染的CLDN4過(guò)表達(dá)細(xì)胞;注射用IncRNA-TUBB2A轉(zhuǎn)染的CLDN4過(guò)表達(dá)細(xì)胞和第6組（lncRNA-TUBB2A+CLDN4）。我們發(fā)現(xiàn)CLDN4組腫瘤腫塊明顯大于pEX2-NC組，miR-596和miR-3620-3p可部分減少CLDN4引起的生長(zhǎng)趨勢(shì)。此外，lncRNA過(guò)表達(dá)組中的腫瘤體積大于CLDN4過(guò)表達(dá)組中的腫瘤體積。                                                      

    在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的共同靶標(biāo)，可以在體外和體內(nèi)顯著增強(qiáng)GC細(xì)胞的增殖和侵襲。在外源引入miR-596和miR-3620-3p后，CLDN4的這些作用降低。我們還觀察到CLDN4，其表達(dá)與miR-596和miR-3620-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在GC組織中上調(diào)，并且與GC患者的不良存活顯著相關(guān)。與上述miRNA對(duì)CLDN4的抑制作用相反，我們的結(jié)果顯示外源性引入lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以提高CLDN4對(duì)增殖和侵襲的作用。所有這些結(jié)果促使我們建議存在一個(gè)值得注意的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中miRNA和lncRNA相互作用以共同調(diào)節(jié)CLDN4的表達(dá)模式和功能（圖10）。

    有報(bào)道LncRNA-ARSR可以充當(dāng)miR-34和miR-449的ceRNA以促進(jìn)AXL和c-MET表達(dá)，從而促進(jìn)腎細(xì)胞癌中的舒尼替尼抗性。在這里，我們顯示lncRNA-KRTAP5-AS1通過(guò)結(jié)合miR-596和miR-3620-3p在體外充當(dāng)致癌基因，并且lncRNA-TUBB2A通過(guò)結(jié)合miR-3620-3p起作用。這表明這兩種lncRNA可以作為ceRNAs。隨后的研究如熒光素酶活性測(cè)定，基于Ago2的RIP和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這兩種lncRNA作為ceRNA調(diào)節(jié)CLDN4。

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