A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumor progression

受調(diào)節(jié)的PNUTS mRNA至lncRNA剪接開關(guān)介導(dǎo)EMT和腫瘤進(jìn)展

期刊：Nature?Cell Biology；影響因子：19.064

發(fā)表單位：南卡羅來納州醫(yī)科大學(xué)      

    ceRNA需要lncRNA, miRNA, mRNA三種分子，miRNA, mRNA可以綜合表達(dá)量變化，保守性，腫瘤重要功能選擇。本研究，lncRNA通過ceRNA機(jī)制調(diào)控腫瘤上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，首先建立EMT模型，芯片篩選差異表達(dá)的lncRNA，而后根據(jù)EMT中的作用及其在物種間的高度保守性選擇其競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的miRNA，而后驗(yàn)證上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換重要的基因作為miRNA靶基因如ZEB，E-鈣粘蛋白。    

    lncRNA對(duì)腫瘤進(jìn)展和驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制的被廣泛研究。在這里，我們發(fā)現(xiàn)異質(zhì)核核糖核蛋白E1（hnRNPE1）與位于PNUTS pre-RNA的外顯子12中的核酸結(jié)構(gòu)元件的結(jié)合，調(diào)節(jié)其可變剪接。允許選擇性剪接并產(chǎn)生PNUTS的非編碼同種型。功能上，lncRNA-PNUTS在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換期間用作miR-205的競(jìng)爭(zhēng)性海綿。lncRNA-PNUTS的表達(dá)升高并且與ZEB mRNA的水平相關(guān)。因此，PNUTS是編碼PNUTS-mRNA和lncRNA-PNUTS的雙功能RNA，每個(gè)都引發(fā)不同的生物學(xué)功能。雖然PNUTS-mRNA普遍表達(dá)，但lncRNA-PNUTS似乎依賴于hnRNPE1的狀態(tài)和腫瘤背景而受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)。

    非編碼RNA最近通過調(diào)節(jié)致癌和腫瘤抑制通路而成為腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵介質(zhì)。LncRNA與細(xì)胞過程有關(guān)，例如增殖，凋亡，遷移和細(xì)胞侵襲，并且已經(jīng)在各種人類癌癥中觀察到它們的失調(diào)表達(dá)。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是在上皮細(xì)胞的腫瘤進(jìn)展期間異常重新激活的發(fā)育過程，并且有助于常規(guī)和靶向治療的抗性。在這里，我們報(bào)告hnRNPE1與PNUTS pre-RNA中的可變剪接位點(diǎn)的結(jié)合，以控制PNUTS的可變剪接同種型的產(chǎn)生，我們將其描述為參與EMT相關(guān)腫瘤進(jìn)展的lncRNA。             

    在NMuMG細(xì)胞中使用hnRNPE1敲低誘導(dǎo)的EMT模型，我們進(jìn)行了Affymetrix陣列分析并鑒定了在hnRNPE1敲低時(shí)下調(diào)的PNUTS pre-RNA，而相關(guān)的PNUTS-mRNA保持相對(duì)不受影響（圖1a）暗示PNUTS pre-RNA的差異處理。有趣的是，人PNUTS基因被描述為編碼兩種測(cè)序變體。雖然變體1編碼了良好表征的PNUTS-mRNA，但變體2尚未被研究并且預(yù)測(cè)為lncRNA（圖1b）。我們使用特異于PNUTS同種型的引物通過RT-PCR分析驗(yàn)證了PNUTS pre-RNA的差異處理（圖1c）。

    我們觀察到乳腺腫瘤樣品中預(yù)測(cè)的lncRNA-PNUTS的上調(diào)以及ZEB1/ZEB2間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)和lncRNA-PNUTS之間的相關(guān)性（圖1d），而不是PNUTS-mRNA。我們還觀察到lncRNA-PNUTS表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的上皮/間充質(zhì)狀態(tài)之間的相關(guān)性。在更多的間充質(zhì)MDA-MB-231細(xì)胞系及其轉(zhuǎn)移性骨（BOM-1833）和轉(zhuǎn)移性肺（LM2-4175）衍生物中，我們觀察到預(yù)測(cè)的lncRNA-PNUTS的表達(dá)增加與間充質(zhì)標(biāo)記物波形蛋白和Zeb1的表達(dá)相關(guān)。

    NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)lncRNA-PNUTS的產(chǎn)生是由于在外顯子12的5'區(qū)域中去除了61個(gè)堿基導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物的開放閱讀框（ORF）中斷（圖1f，1g）。并且northern-blot驗(yàn)證了全長lncRNA-PNUTS的大小及其在hnRNPE1敲低后的上調(diào)（圖1i）。

    PNUTS基因的外顯子12中的備選剪接位點(diǎn)也由HSFfinder在計(jì)算機(jī)上預(yù)測(cè)。有趣的是，該剪接位點(diǎn)具有比用于產(chǎn)生PNUTS-mRNA的常規(guī)剪接位點(diǎn)（79.38）更高的共有剪接位點(diǎn)值（91.74），表明存在選擇性剪接位點(diǎn)利用的抑制機(jī)制。由于hnRNPE1是已知的選擇性剪接的抑制因子并且其敲低導(dǎo)致lncRNA-PNUTS的上調(diào)，我們推測(cè)它是PNUTS pre-RNA剪接的內(nèi)源阻遏物。

    我們先前描述了hnRNPE1結(jié)合共有BAT元件，其由具有位于RNAs的3'-UTR中的不對(duì)稱凸起的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成。對(duì)人和小鼠序列中PNUTS可變剪接位點(diǎn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析揭示了存在類似的進(jìn)化保守的BAT樣元件，其包含可變剪接位點(diǎn)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)了PNUTSBAT選擇性剪接位點(diǎn)RNA探針，野生型或突變，以進(jìn)行RNA電動(dòng)轉(zhuǎn)移測(cè)定（REMSA）并驗(yàn)證hnRNPE1與結(jié)構(gòu)元件的直接和特異性結(jié)合。結(jié)果表明hnRNPE1與PNUTS pre-RNA選擇性剪接位點(diǎn)的結(jié)合介導(dǎo)了對(duì)可變剪接的抑制作用。

    PNUTS mRNA編碼99 kDa PNUTS蛋白。多核糖體分級(jí)分析，與PNUTS mRNA相比，僅在非翻譯單體組分中觀察到lncRNA-PNUTS而在活躍翻譯的多核組分中沒有觀察到，說明了其不可翻譯性。最后，內(nèi)源性lncRNA-PNUTS具有poly（A）尾，并且通過細(xì)胞組分分析，使用MS2-Tag策略和FISH分析的GFP跟蹤顯微鏡觀察位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。

    鑒于lncRNA-PNUTS的亞細(xì)胞定位，我們接下來將其生物學(xué)功能探索為假定的競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA（ceRNA）。通過計(jì)算機(jī)分析，我們預(yù)測(cè)了21個(gè)靶向至少5個(gè)位點(diǎn)的miRNA，得分高于0.6。miR-205由于其在EMT中的關(guān)鍵作用及其在物種間的高度保守性而成為明顯的候選物。我們使用定量實(shí)時(shí)PCR來量化每個(gè)細(xì)胞的miR-205和lncRNA-PNUTS的拷貝數(shù)，因?yàn)榭杀容^的水平暗示了ceRNA功能。FISH分析顯示miR-205與lncRNA-PNUTS而非PNUTS-mRNA的共定位。這表明miR-205與lncRNA同種型的優(yōu)先相互作用，其通過使用生物素化的反義探針進(jìn)一步證實(shí)。LncRNA-PNUTS含有7個(gè)miR-205位點(diǎn)，包括位于同源PNUTS mRNA的3'-UTR中的位點(diǎn)。

    由于lncRNA-PNUTS與miRNA-205相互作用，miRNA-205是一種成熟的ZEB蛋白和上皮細(xì)胞維持的調(diào)節(jié)因子，我們研究了它對(duì)ZEB表達(dá)和細(xì)胞可塑性的影響。我們沉默內(nèi)源性lncRNA-PNUTS在間充質(zhì)和侵襲性MDA231-LM2-4175細(xì)胞中表達(dá)高水平的lncRNA，以測(cè)試lncRNA-PNUTS是否可以調(diào)節(jié)細(xì)胞可塑性。LncRNA-PNUTS沉默導(dǎo)致細(xì)胞侵襲的顯著降低與波形蛋白表達(dá)減少（間充質(zhì)標(biāo)記物）和上皮標(biāo)記物E-鈣粘蛋白的重新表達(dá)相關(guān)，伴隨形態(tài)變化。此外，lncRNA-PNUTS的過表達(dá)在A549和NMuMG中誘導(dǎo)EMT，其特征在于從上皮樣，鵝卵石表型到更多紡錘形的間充質(zhì)表型，E-鈣粘蛋白/波形蛋白轉(zhuǎn)換的形態(tài)學(xué)變化，以及伴隨的EMT-TF，ZEB1，ZEB2，SNAI1和SNAI2水平的增加。雖然野生型lncRNA-PNUTS誘導(dǎo)與E-鈣粘蛋白下調(diào)和ZEB1上調(diào)相關(guān)的EMT，但miRNA-205的共轉(zhuǎn)染以及lncRNA-PNUTS的miR-205-突變體形式的過表達(dá)消除了這個(gè)效果。lncRNA-PNUTS以miR-205結(jié)合位點(diǎn)依賴性方式控制A549和NMuMG細(xì)胞的遷移和侵襲，并且miR-205過表達(dá)能夠消除這種效應(yīng)。

    使用熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，我們接下來通過lncRNA-PNUTS驗(yàn)證了miR-205/ZEB/E-鈣粘蛋白軸的調(diào)節(jié)。我們首先通過克隆lncRNA-PNUTS的S3-S6-miR-205結(jié)合位點(diǎn)作為熒光素酶CDS的3'-UTR證實(shí)了miR-205與lncRNA-PNUTS的結(jié)合，并證明了共轉(zhuǎn)染A549和NMUMG細(xì)胞中的miR-205降低了野生型（WT）的熒光素酶表達(dá)，但沒有突變的S3-S6-miR205構(gòu)建體。其次，使用熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體，其穩(wěn)定性依賴于miR-205結(jié)合，我們證明了WT，而不是miR-205-突變的lncRNA-PNUTS降低了miR-205的生物利用度。第三，使用與ZEB3'-UTR融合的海腎結(jié)構(gòu)，我們觀察到WT lncRNA-PNUTS穩(wěn)定了ZEBs 3'-UTR，并且使用miR-205突變的lncRNA或通過與miR-205模擬物共轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)部分地消除了這種效應(yīng)。重要的是，對(duì)于其miR-205結(jié)合位點(diǎn)突變的ZEB13'-UTR沒有觀察到效果。最后，使用含有野生型或突變型ZEBs結(jié)合位點(diǎn)（E盒）的E-鈣粘蛋白（CDH1）啟動(dòng)子熒光素酶構(gòu)建體，我們觀察到lncRNA-PNUTS過表達(dá)后熒光素酶活性降低約50％。

    鑒于miR-205在通過EMT調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞命運(yùn)和腫瘤發(fā)生中的作用，我們研究了lncRNA-PNUTS是否有助于這些表型。利用立體球形成測(cè)定法，我們顯示依賴于miR-205結(jié)合位點(diǎn)的lncRNA-PNUTS誘導(dǎo)的A549和NMuMG細(xì)胞的球形成顯著增加。我們接下來測(cè)試了lncRNA-PNUTS對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的影響，并證明當(dāng)在原位注射到乳腺脂肪墊中時(shí)，MDA-231-LM2細(xì)胞中lncRNA-PNUTS的沉默損害腫瘤形成。此外，lncRNA-PNUTS也有助于體內(nèi)轉(zhuǎn)移，因?yàn)槲覀冇^察到與其雜亂控制對(duì)照組相比，對(duì)于lncRNA-PNUTS沉默的MDA-231-LM2細(xì)胞中肺定植顯著減少。              

    LncRNA-PNUTS定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，雖然其作為ceRNA的功能可歸因于其細(xì)胞質(zhì)定位，但其在核區(qū)室中的作用未在本文中研究。lncRNA-PNUTS的核生物發(fā)生可能解釋了它在細(xì)胞核中的定位，盡管我們推測(cè)它也可能參與核過程，如轉(zhuǎn)錄或表觀遺傳調(diào)控，如同其他先前描述的lncRNAs。