Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA

外泌體傳播的lncARSR通過作為競爭性內(nèi)源RNA促進(jìn)舒尼替尼在腎癌中的耐藥性

期刊：Cancer Cell；影響因子：22.844               

發(fā)表單位：上海長征醫(yī)院                                                        

    之前介紹過lncRNA在腫瘤耐藥中發(fā)揮作用，“Nature medicine：EGFR同義突變引起靶向藥耐藥是由lncRNA EGFR-AS1介導(dǎo)的 （IF：32.621）”，“腫瘤耐藥中lncRNA, miRNA是怎么發(fā)揮作用的呢”。本研究篩選耐藥相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)lncARSR促進(jìn)腎細(xì)胞癌舒尼替尼耐藥。定位細(xì)胞質(zhì)lnc，常以ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用，如“這篇lncRNA ceRNA機(jī)制如何發(fā)到 IF12分的”，“胃癌lncRNA ceRNA機(jī)制研究”，本研究同樣選擇ceRNA闡釋耐藥機(jī)制，揭示lncARSR通過競爭性結(jié)合miR-34/miR-449促進(jìn)AXL和c-MET表達(dá)，促進(jìn)舒尼替尼耐藥。                             

    舒尼替尼耐藥是晚期腎細(xì)胞癌（RCC）的主要挑戰(zhàn)。迫切需要了解耐藥機(jī)制并制定效策略。在這里，我們確定了一種名為lncARSR的lncRNA，與舒尼替尼耐藥相關(guān)。lncARSR通過競爭性結(jié)合miR-34/miR-449促進(jìn)AXL和c-MET表達(dá)，促進(jìn)舒尼替尼耐藥。此外，生物活性lncARSR可以整合到外泌體中并傳播到敏感細(xì)胞，從而傳播舒尼替尼耐藥性。                       

    舒尼替尼是一種口服多靶點(diǎn)RTK抑制劑，由于抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR），血小板衍生生長因子受體，干細(xì)胞生長因子受體和FMS樣酪氨酸激酶3，具有有效的抗血管生成作用和直接的抗腫瘤活性。然而，10％-20％的晚期RCC患者本身對舒尼替尼治療無效，并且大多數(shù)剩余患者在治療6-15個(gè)月后最終導(dǎo)致耐藥性和腫瘤進(jìn)展。一些研究表明，通過蛋白質(zhì)和miRNA的轉(zhuǎn)移，來自基質(zhì)細(xì)胞的外泌體可能潛在地影響治療反應(yīng)。然而，需要闡明來自抗性癌細(xì)胞的外泌體是否能賦予敏感細(xì)胞耐藥性。此外，包含在循環(huán)外泌體中的成分可作為評估患者藥物反應(yīng)的易于獲得的生物標(biāo)志物。

    通過基于靶向lncARSR的LNA治療恢復(fù)了體內(nèi)抗性RCC細(xì)胞的舒尼替尼反應(yīng)。此外，AXL/c-MET抑制劑的施用克服了內(nèi)在和適應(yīng)性舒尼替尼耐藥性，表明舒尼替尼治療與舒尼替尼難治性RCC患者中的AXL/c-MET抑制劑的臨床組合。                             

    為了獲得舒尼替尼耐藥的RCC細(xì)胞，我們將786-O和ACHN細(xì)胞移植到裸鼠中并進(jìn)行舒尼替尼治療的循環(huán)以及體內(nèi)連續(xù)傳代。來自第三代的RCC異種移植物顯示對舒尼替尼治療的不良反應(yīng)和組成型激活的STAT3，AKT和ERK。從這些異種移植物中分離出抗性RCC細(xì)胞，分別命名為7Su3rd和ACSu3rd。三輪篩查lncRNA。首先，利用lncRNA微陣列比較親代和抗性細(xì)胞lncRNA表達(dá)譜。熱圖顯示了親代和抗性細(xì)胞之間的明顯區(qū)別（圖1B，左圖）。qRT-PCR對67個(gè)表達(dá)差異大的lncRNA（倍數(shù)變化>5）進(jìn)行驗(yàn)證。第三，通過RNAi對8種選擇的lncRNA進(jìn)行舒尼替尼抗性RCC細(xì)胞的功能喪失分析。值得注意的是，lncRNARP11-375O18.2-001的干擾（Ensembl：ENST00000424980）與其余7種lncRNA相比，抑制舒尼替尼耐藥。通過RACE測定確定lncARSR位于人類的9號染色體上，由4個(gè)外顯子組成，全長591nt。通過編碼潛力分析證實(shí)了lncARSR的非編碼特性。

    我們接下來研究了舒尼替尼耐藥RCC細(xì)胞中lncARSR上調(diào)的潛在機(jī)制。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的抑制對RCC細(xì)胞中的lncARSR表達(dá)沒有影響。lncARSR的啟動(dòng)子區(qū)域（2000至200bp）的生物信息學(xué)分析預(yù)測了FOXO1和FOXO3a的三種DNA結(jié)合元件（DBE）。高表達(dá)FOXO1（FOXO1-A3）或FOXO3a（FOXO3a-A3）的轉(zhuǎn)染顯著下調(diào)舒尼替尼耐藥細(xì)胞中的lncARSR水平。組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹和丁酸鈉消除了FOXO1或FOXO3a觸發(fā)的lncARSR轉(zhuǎn)錄抑制，表明FOXO1和FOXO3a可能通過募集組蛋白去乙酰化酶作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，與之前的報(bào)道一致。

    先前報(bào)道，激活的AKT可以誘導(dǎo)FOXO家族的磷酸化和細(xì)胞質(zhì)保留，從而進(jìn)行蛋白酶體降解。實(shí)際上，在舒尼替尼抗性細(xì)胞中敲低AKT抑制了lncARSR表達(dá)并增加了核易位和FOXO1和FOXO3a的表達(dá)。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明，激活的AKT對FOXO1和FOXO3a的抑制作用至少部分導(dǎo)致了舒尼替尼耐藥的RCC細(xì)胞中lncARSR的上調(diào)。

    為了進(jìn)一步闡明lncARSR在舒尼替尼耐藥中的功能作用，我們穩(wěn)定地敲低了lncARSR。抗性細(xì)胞中l(wèi)ncARSR的敲低導(dǎo)致舒尼替尼治療后IC₅₀顯著降低和抑制非錨定依賴性生長。在sunitinib治療后，抗性細(xì)胞中的lncARSR敲低導(dǎo)致STAT3，AKT和ERK信號傳導(dǎo)的有效抑制和增加的聚（ADP核糖）聚合酶切割，表明抑制lncARSR恢復(fù)了對抗性細(xì)胞的舒尼替尼反應(yīng)。

    為了檢查lncARSR是否可能存在于細(xì)胞外環(huán)境中，我們在RCC細(xì)胞的培養(yǎng)基（CM）和RCC患者的血漿中提取RNA。RCC患者的血漿lncARSR水平增加。此外，腫瘤切除后血漿lncARSR水平降低，腫瘤復(fù)發(fā)后再次升高，表明血漿lncARSR主要由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生。與舒尼替尼耐藥細(xì)胞中lncARSR的上調(diào)一致，抗性細(xì)胞的CM中的lncARSR水平顯著高于親代細(xì)胞中的水平。

    我們接下來探討了循環(huán)lncARSR是否可以預(yù)測RCC患者的舒尼替尼反應(yīng)。在舒尼替尼治療期間患有進(jìn)行性疾病（PD）的患者中，治療前血漿中的lncARSR的平均水平高于沒有PD的患者（非PD）。此外，Kaplan-Meier分析顯示，治療前血漿中的高lncARSR水平與舒尼替尼治療的RCC患者的無進(jìn)展生存期（PFS）降低相關(guān)。這種相關(guān)性在轉(zhuǎn)移性環(huán)境中甚至更顯著。

    我們接下來研究了細(xì)胞外lncARSR的現(xiàn)有模式。CM中的lncARSR水平在RNase處理時(shí)沒有變化，但當(dāng)同時(shí)用RNase和TritonX-100處理時(shí)顯著降低，表明細(xì)胞外lncARSR主要由膜包裹而不是直接釋放。然后我們從CM中純化外泌體并通過外泌體標(biāo)記TSG101和CD9確認(rèn)它們的特性。有趣的是，外泌體中的lncARSR水平幾乎與整個(gè)CM中的水平相等，表明外泌體是細(xì)胞外lncARSR的主要載體。從舒尼替尼抗性和親代RCC細(xì)胞分離的外泌體顯示出相似的典型杯形形態(tài)，大小和數(shù)量。如所預(yù)期的，在舒尼替尼抗性RCC細(xì)胞中外泌體lncARSR水平顯著高于親代細(xì)胞。

    我們進(jìn)一步檢查了外泌體轉(zhuǎn)移的lncARSR是否可以將抗性表型賦予受體RCC細(xì)胞。在共培養(yǎng)集落形成測定中，當(dāng)與RFP標(biāo)記的舒尼替尼抗性細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，GFP標(biāo)記的親代細(xì)胞變得對舒尼替尼不敏感，而親代細(xì)胞中的lncARSR敲低消除了這種效應(yīng)。為了探究外泌體是否在這種作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們通過RNAi干擾RAB27A/B表達(dá)或使用GW4869對中性鞘磷脂酶-2（nSMase）進(jìn)行藥理學(xué)抑制來減少外泌體的產(chǎn)生。如圖S4G所示，在RAB27A/B敲低或nSMase抑制后，CM中的外泌體數(shù)量顯著減少，而對細(xì)胞活力和細(xì)胞內(nèi)lncARSR水平?jīng)]有影響。重要的是，來自7Su3rd細(xì)胞的具有RAB27A/B敲低或GW4869處理的CM未能賦予對受體細(xì)胞的舒尼替尼抗性，表明外泌體對于轉(zhuǎn)移抗性的關(guān)鍵作用。為了證明外泌體lncARSR對體內(nèi)舒尼替尼反應(yīng)的影響，我們將來自舒尼替尼抗性和親代細(xì)胞的外泌體瘤內(nèi)注射到786-O異種移植物中。伴隨著腫瘤中l(wèi)ncARSR表達(dá)的增加，來自舒尼替尼抗性細(xì)胞而非親代細(xì)胞的外泌體顯著抑制了RCC異種移植物對舒尼替尼的反應(yīng)。

    我們進(jìn)一步尋求鑒定lncARSR驅(qū)動(dòng)的舒尼替尼耐藥的介質(zhì)。越來越多的證據(jù)表明激活替代性RTK作為耐藥性中的關(guān)鍵角色。因此，我們在抗性細(xì)胞中篩選了多個(gè)RTK，并發(fā)現(xiàn)lncARSR敲低在其磷酸化水平以及mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)上可重復(fù)地降低AXL和c-MET。一致地，在舒尼替尼抗性異種移植物和舒尼替尼治療后臨床復(fù)發(fā)的腫瘤中觀察到AXL和c-MET的高表達(dá)。我們接下來確定AXL和c-MET是否功能性地參與lncARSR介導(dǎo)的舒尼替尼耐藥。AXL和c-MET的恢復(fù)在lncARSR敲低抗性細(xì)胞中重現(xiàn)了舒尼替尼抗性表型和下游信號傳導(dǎo)。相反，AXL和c-MET的同時(shí)敲低在生存力和下游信號傳導(dǎo)方面消除了lncARSR介導(dǎo)的舒尼替尼抗性，而單獨(dú)敲低每種都具有有限的作用。

    由于lncARSR主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，它可能作為競爭性內(nèi)源RNA起到隔離miRNA的作用，從而導(dǎo)致相應(yīng)的miRNA靶向轉(zhuǎn)錄物的釋放。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們首先用Dicer特異性siRNA轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞以有效阻斷miRNA生物合成。有趣的是，當(dāng)敲低Dicer時(shí)，lncARSR介導(dǎo)的AXL和c-MET的上調(diào)被消除。TargetScan和Miranda分析揭示了由lncARSR和AXL和c-MET的3'UTR共享的miR-34和miR-449的四個(gè)推定的miRNA反應(yīng)元件（MRE）。有趣的是，miR-34和miR-449在結(jié)構(gòu)上相關(guān)并且共享相同的“種子”序列。MRE位于lncARSR序列的相對短的跨度中（位置300-400nt）。此外，每個(gè)舒尼替尼抗性細(xì)胞檢測到可比較的拷貝數(shù)lncARSR和miR-34/449，這對于ceRNA-miRNA的相互作用是重要的。熒光素酶活性數(shù)據(jù)證明lncARSR含有功能性miR-34和miR-449結(jié)合位點(diǎn)。此外，用miR-34a海綿抑制miR-34和miR-449足以在lncARSR敲低后恢復(fù)舒尼替尼抗性。相反，引入miR-34模擬物消除了lncARSR介導(dǎo)的舒尼替尼抗性。

    為了評估lncARSR在體內(nèi)舒尼替尼耐藥性RCC中的治療潛力，我們在771R-Rluc細(xì)胞的原位異種移植物模型中系統(tǒng)地施用靶向lncARSR的優(yōu)化LNA。生物發(fā)光成像顯示，治療性lncARSRLNA有效地恢復(fù)了771R-Rluc異種移植物對并發(fā)舒尼替尼治療的敏感性）。28天后停止治療，但即使在2個(gè)月后，在聯(lián)合治療組中也未觀察到腫瘤再生。

    此外，我們評估了來自RCC患者的PDX模型中lncARSR阻斷的治療潛力，所述RCC患者獲得對舒尼替尼的部分反應(yīng)但在獲得性抗性的13個(gè)月后復(fù)發(fā)。靶向lncARSR的LNA將PDX R1重新敏化為舒尼替尼治療，伴隨治療后腫瘤中lncARSR和AXL/c-MET水平的降低。而且，在治療期間沒有觀察到顯著的小鼠體重減輕。這些結(jié)果表明，體內(nèi)靶向lncARSR可以恢復(fù)RCC的舒尼替尼反應(yīng)。                          

    對舒尼替尼產(chǎn)生耐藥性的晚期RCC患者目前在臨床上的治療選擇有限。在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一種未表征的lncRNA，lncARSR在舒尼替尼耐藥的RCC中高度表達(dá)，并且對抗性表型具有功能性。lncARSR通過競爭性結(jié)合miR-34和miR-449促進(jìn)舒尼替尼耐藥，導(dǎo)致AXL/c-MET的上調(diào)和STAT3，AKT和ERK信號傳導(dǎo)的激活。

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