The lncRNA CASC9 and RNA binding protein HNRNPL form a complex and co-regulate genes linked to AKT signaling

lncRNA CASC9和RNA結(jié)合蛋白HNRNPL形成與AKT信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的復(fù)合和共調(diào)節(jié)基因

期刊：Hepatology；影響因子：1

發(fā)表單位：海德堡大學(xué)     

    尋找與細(xì)胞活力相關(guān)的lncRNA，常見(jiàn)方法是先獲取高活力的細(xì)胞和低活力的細(xì)胞，而后lncRNA測(cè)序或芯片篩選，本研究在肝癌細(xì)胞系中，設(shè)計(jì)了針對(duì)638癌相關(guān)的lncRNA siRNA庫(kù)，而后處理細(xì)胞，篩選活力顯著變化處理組確定發(fā)揮功能的lncRNA，而后進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)合TCGA等臨床數(shù)據(jù)分析驗(yàn)證其功能。

    研究細(xì)胞活力相關(guān)的lncRNA可能是肝癌新治療方法之一。在這里，我們在肝細(xì)胞癌（HCC）細(xì)胞系中應(yīng)用了RNAi篩選方法來(lái)尋找與細(xì)胞活力相關(guān)的lncRNA。我們發(fā)現(xiàn)CASC9，其表型，表達(dá)在HCC中變化顯著。CASC9降低導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和增殖減少。RNA親和純化鑒定RNA結(jié)合蛋白異質(zhì)核核糖核蛋白L（HNRNPL）作為CASC9相互作用蛋白。HNRNPL的敲減重現(xiàn)了CASC9降低時(shí)觀察到的活力喪失。蛋白質(zhì)組分析暗示CASC9：HNRNPL復(fù)合物在AKT-signaling和DNA damage sensing中的作用。腫瘤中CASC9表達(dá)水平升高，并且與HCC患者的總體存活率顯著相關(guān)。敲低CASC9后腫瘤尺寸的減小。

    大多數(shù)人類(lèi)基因是ncRNA基因，而不是蛋白質(zhì)編碼基因。因此，ncRNA基因，特別是長(zhǎng)的非編碼RNA（lncRNA）基因，在過(guò)去幾年中得到了強(qiáng)烈的研究，可能與各種生理和病理功能有關(guān)，包括肝癌發(fā)生。

通常，lncRNA通過(guò)與細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)的直接相互作用發(fā)揮其功能。在細(xì)胞核中，lncRNA可以作為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子或表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的靶向特異性的引導(dǎo)。在細(xì)胞質(zhì)中，lncRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，例如，基因表達(dá)，RNA穩(wěn)定性或翻譯。比如DANCR結(jié)合CTNNB1的3’非翻譯區(qū)并阻斷miRNA結(jié)合位點(diǎn)，而UFC1通過(guò)將RNA結(jié)合蛋白ELAVL1（HuR）募集至CTNNB1而起作用。在這項(xiàng)研究中，我們旨在識(shí)別HCC中與活力相關(guān)的lncRNAs。為此，我們使用定制的RNAi文庫(kù)，該文庫(kù)靶向638個(gè)癌癥相關(guān)的lncRNA。

    siRNA文庫(kù)，篩選和驗(yàn)證：如前所述涉及靶向638個(gè)潛在致癌的lncRNA的> 3100個(gè)siRNA組成的siRNA文庫(kù)。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中384孔板中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)染。為了驗(yàn)證，潛在的lncRNA重新分配siRNA并如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用HTS2 R包分析數(shù)據(jù)，挑選活力變化較大的lncRNA進(jìn)行后續(xù)分析。

    通過(guò)基于微陣列32個(gè)腫瘤樣本與7個(gè)正常肝臟樣品分析HCC的lncRNA表達(dá)譜。為了獲得與癌癥相關(guān)lncRNA，設(shè)計(jì)siRNA文庫(kù)，探討lncRNA在癌癥中的應(yīng)用。總共產(chǎn)生638個(gè)顯著失調(diào)的lncRNA，大多數(shù)是上調(diào)的。轉(zhuǎn)染72小時(shí)，用基于發(fā)光的測(cè)定法測(cè)量活力。活力增加高的基因是MIR217，它是腫瘤抑制性miRNA宿主基因（圖1B），宿主lncRNA功能研究參考“宿主lncRNA與miRNA是否有關(guān)系呢？”。我們?cè)u(píng)估了具有高活力降低前50個(gè)基因，并排除了非lncRNA。通過(guò)RT-qPCR分析剩余的21個(gè)lncRNA在5個(gè)HCC細(xì)胞系（HLE，HLF，Huh-7，HepG2，PLC）中的基礎(chǔ)表達(dá)，并與正常肝組織進(jìn)行差異表達(dá)，以及通過(guò)編碼潛力評(píng)估工具（CPAT）評(píng)分來(lái)確定編碼能力。LncRNA CASC9顯示所有四個(gè)參數(shù)的佳組合：CASC9缺失具有強(qiáng)表型，其表達(dá)在所有被測(cè)試的HCC細(xì)胞系中均可檢測(cè)到，其在HCC腫瘤樣本表達(dá)上調(diào)，并且顯示出非常低的編碼概率。

    單個(gè)siRNA可能引起脫靶效應(yīng)，siPOOL技術(shù)使用30個(gè)單一siRNA靶向一個(gè)基因，每個(gè)siRNA濃度非常低，從而有效地減弱潛在的脫靶效應(yīng)。

與用靶向CASC9的單個(gè)siRNA處理后觀察到的結(jié)果一致，我們?cè)?/span>HLE（-31％）和 Huh-7（-22％）中的使用靶向CASC9（siCASC9）的siPOOLs觀察到相同的活力喪失表現(xiàn)。在總共11個(gè)細(xì)胞系的8個(gè)中CASC9敲低后活力顯著降低。為了闡明活力喪失是由代謝變化還是增殖缺陷引起，使用BrdU測(cè)定來(lái)評(píng)估HLE和SNU-387細(xì)胞的增殖速率。兩種細(xì)胞系中的增殖率都顯著降低超過(guò)25％。

    接下來(lái)，進(jìn)一步研究CASC9基因及其產(chǎn)物。根據(jù)Ensembl，CASC9基因有五個(gè)外顯子，有四種同種型。qPCR顯示CASC9-004是HLE和SNU-387細(xì)胞中豐富的同種型，分別占總轉(zhuǎn)錄物的72％和40％。我們關(guān)注豐富的同種型CASC9-004，其被稱(chēng)為CASC9。通過(guò)RT-qPCR測(cè)試一組73個(gè)不同來(lái)源的人細(xì)胞系（主要是癌細(xì)胞系）的CASC9表達(dá)水平。CASC9在來(lái)自不同組織和癌癥實(shí)體的各種細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，在源自非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌或?qū)m頸癌的細(xì)胞系中具有與HCC細(xì)胞系相似的表達(dá)。用三種計(jì)算機(jī)工具預(yù)測(cè)CASC9的編碼概率，即CPAT，CPC和PhyloCSF。CASC9的CPAT和CPC得分與MALAT1等成熟的非編碼RNA一樣低。此外，PhyloCSF沒(méi)有高密碼子保守區(qū)域，表明CASC9的非編碼性質(zhì)。亞細(xì)胞定位分析顯示兩種CASC9同種型主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，表明其在細(xì)胞質(zhì)中的主要作用。

    為了闡明CASC9和潛在結(jié)合的蛋白質(zhì)，進(jìn)行了RNA親和純化（RAP）實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)到CASC9泳道中約65kDa的特定條帶。質(zhì)譜法鑒定，異構(gòu)核核糖核蛋白L（HNRNPL）出現(xiàn)在列表的頂部。

此外，我們通過(guò)逆實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了CASC9和HNRNPL的相互作用，即HLE細(xì)胞中的天然RNA免疫沉淀（RIP）方法。與IgG-RIP樣品相比，在HNRNPL-RIP中CASC9顯著富集約300倍，而HuR-RIP中CASC9的富集低10倍。相反，與IgG-RIP相比，MALAT1在HuR-RIP中顯示出超過(guò)300倍的顯著富集（圖4F）。

    為了檢查CASC9和HNRNPL的潛在功能，我們使用siPOOLs在HLE細(xì)胞中進(jìn)行了HNRNPL的敲低。HNRNPL mRNA的敲低效率為95％，HNRNPL蛋白的敲低效率為66％。HNRNPL的敲低顯示出顯著的30％生存力降低，在效果，方向和程度方面模擬了CASC9敲低的活力喪失表現(xiàn)。HNRNPL主要定位于細(xì)胞核并參與RNA的轉(zhuǎn)錄，剪接和加工。為了鑒定CASC9或HNRNPL的缺失導(dǎo)致共同異常表達(dá)的基因，我們用HLE細(xì)胞中的細(xì)胞培養(yǎng)物（SILAC）中的氨基酸進(jìn)行了穩(wěn)定同位素標(biāo)記，比較了CASC9和HNRNPL的敲低引起基因的變化。299蛋白質(zhì)上調(diào)和248個(gè)下調(diào)。CASC9敲低對(duì)HNRNPL mRNA或蛋白質(zhì)水平都沒(méi)有強(qiáng)烈影響，也沒(méi)有對(duì)CASC9表達(dá)的HNRNPL敲低。IPA分析顯示侵襲和粘附相關(guān)通路的減少，例如，整合素和CDC42-信號(hào)傳導(dǎo)以及增殖和活力通路如PI3K/AKT和ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路。在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析中，AKT1是CASC9列表以及單獨(dú)的HNRNPL敲低中重要的調(diào)節(jié)分子。

該發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了CASC9：HNRNPL復(fù)合物可能通過(guò)影響PI3K / AKT信號(hào)級(jí)聯(lián)來(lái)調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞活力的假設(shè)。為了測(cè)試該假設(shè)，在CASC9和HNRNPL敲低后分析AKT的磷酸化（p-AKT）和總PTEN水平。通過(guò)使用絲氨酸473磷酸特異性抗體，在siCASC9-和siHNRNPL-處理的HLE細(xì)胞中檢測(cè)到p-AKT水平的顯著降低，其是AKT-信號(hào)傳導(dǎo)活性的指示物。相反，PTEN的蛋白質(zhì)水平基本保持不變。對(duì)SILAC數(shù)據(jù)集的檢查顯示，102個(gè)共同調(diào)節(jié)基因中的23個(gè)與DNA損傷感應(yīng)/反應(yīng)通路相關(guān)，這進(jìn)一步支持了CASC9：HNRNPL復(fù)合物可能參與DNA損傷傳感/響應(yīng)的調(diào)節(jié)的假設(shè)。

    分析肝癌基因組圖譜CGA數(shù)據(jù)集中腫瘤與正常樣品中CASC9的表達(dá)，TCGA數(shù)據(jù)挖掘可以參考“重磅: TCGA乳腺癌mRNA, lncRNA, miRNA數(shù)據(jù)挖掘（含分析結(jié)果）”。CASC9在HCC腫瘤樣品中顯著更高表達(dá)（圖6A）。在線資源miTranscriptome顯示CASC9不僅在HCC腫瘤中高表達(dá)，而且在例如肺，膀胱，頭頸部和結(jié)直腸癌同樣高表達(dá)。生存分析發(fā)現(xiàn)HCC中的CASC9表達(dá)水平與HCC患者的總體存活相關(guān)。在接種CAM之前24小時(shí)，使用RNAi（siCASC9）在體外進(jìn)行HLE細(xì)胞中的CASC9敲低。在CAM上生長(zhǎng)一周后收獲腫瘤，測(cè)定CASC9敲低和對(duì)照siRNA處理的腫瘤的重量。與對(duì)照腫瘤相比，腫瘤重量的定量分析顯示總腫瘤重量的顯著減少49％（圖6E）。

    到目前為止，只有少數(shù)研究使用基于RNAi的方法來(lái)搜索與活力相關(guān)的lncRNAs。據(jù)我們所知，這項(xiàng)研究是第一項(xiàng)應(yīng)用功能性siRNA篩查在肝細(xì)胞癌中喪失生存力的lncRNAs的研究。篩選結(jié)果與其他研究結(jié)果非常吻合：已知lncRNA基因HOTAIR，LINC00152，PVT1和HULC對(duì)癌細(xì)胞存活率很重要。我們發(fā)現(xiàn)CASC9減少的影響是由混合表型引起的，包括增殖喪失和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。其他研究將CASC9的細(xì)胞表型與EMT和侵襲受損聯(lián)系起來(lái)。然而，之前提出的參與EMT的CASC9靶基因如VIM，CDH1，CDH2和SNAI1沒(méi)有差異表達(dá)，這可能表明腫瘤類(lèi)型特異性差異。

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