Expression of long non-coding RNA YIYA promotes glycolysis in breast cancer

長(zhǎng)非編碼RNA YIYA的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌中的糖酵解

    期刊：Cancer Research；影響因子：9.130

前一篇微文我們介紹了lncRNA在精神分裂癥患者腦杏仁核區(qū)域的表達(dá)譜“精神分裂癥患者腦杏仁核組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜”。lncRNA在癌中發(fā)揮作用報(bào)道的很多，然而其調(diào)控細(xì)胞代謝如糖酵解過(guò)程的報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA YIYA可以與CDK6蛋白直接結(jié)合，介導(dǎo)PFKFB3的磷酸化，促進(jìn)糖酵解中葡萄糖代謝，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）尚未在癌代謝領(lǐng)域研究過(guò)。在這里，我們報(bào)告lncRNA LINC00538（YIYA）的上調(diào)促進(jìn)乳腺癌中的糖酵解，細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。YIYA與細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞周期蛋白激酶CDK6相關(guān)，并以細(xì)胞周期非依賴的方式調(diào)節(jié)果糖二磷酸酶PFK2（PFKFB3）的CDK6依賴性磷酸化。在乳腺癌細(xì)胞中，這些事件促進(jìn)葡萄糖6-磷酸催化成果糖-2,6-二磷酸酯/果糖-1,6-二磷酸酯。

一種名為YIYA的長(zhǎng)非編碼RNA被證明在多種癌癥類型中被上調(diào)。YIYA位于1q41，這是一個(gè)癌癥易感基因位點(diǎn)。YIYA基因也被擴(kuò)增，其表達(dá)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖有關(guān)。

人類癌癥的標(biāo)志之一是葡萄糖代謝的改變。升高的糖酵解（也稱為Warburg效應(yīng)）促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)，血管生成和轉(zhuǎn)移。葡萄糖代謝的關(guān)鍵步驟之一是葡萄糖6-磷酸（G6P）轉(zhuǎn)化為果糖-1,6-二磷酸（F-1,6-BP）或果糖-2,6-二磷酸（F-2,6-BP），其分別由6-磷酸果糖-1-激酶（PFK1）或6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶（PFKFB3）介導(dǎo)。PFK1的酶活性由F-2,6-BP變構(gòu)激活。PFKFB3的抑制降低了PFK1和葡萄糖通量的酶活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞生長(zhǎng)減少。

使用RNAscope技術(shù)確定YIYA在乳腺癌組織中與配對(duì)的相鄰正常組織中的表達(dá)狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)超過(guò)50％的乳腺癌患者表達(dá)YIYA且不到5％的鄰近正常組織表現(xiàn)出可檢測(cè)的YIYA表達(dá)（fig1）。具有高YIYA表達(dá)的乳腺癌患者表現(xiàn)出較差的無(wú)復(fù)發(fā)存活率。與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，YIYA在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)。YIYA的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖速率，但對(duì)細(xì)胞周期的影響小，表明YIYA可能在促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮額外作用，這與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)無(wú)關(guān)。

我們使用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生來(lái)自MDA-MB-231細(xì)胞的敲除（KO）細(xì)胞系，YIYA敲低顯著減少了三維腫瘤球體的生長(zhǎng)和侵襲。將親本或YIYA 敲低細(xì)胞原位注射到小鼠的乳腺脂肪中表明當(dāng)YIYA耗盡時(shí)乳腺腫瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制。因此，我們的數(shù)據(jù)證明了YIYA在乳腺癌細(xì)胞中的潛在致癌作用。

為了解YIYA促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制，我們使用LC-MS鑒定了YIYA的結(jié)合蛋白。與空白對(duì)照和反義YIYA相比，正義YIYA 與SKP1、 FBXW7和CDK6具有高度相關(guān)性。我們證實(shí)了CDK6/cyclin-D3，CDK6/SKP1和CDK6/FBXW7之間的相互作用。免疫共沉淀還表明FBXW7分別與CDK6和SKP1相關(guān)。然后我們證明YIYA，CDK6和cyclin-D3定位于細(xì)胞核和胞質(zhì)，但主要定位于胞質(zhì)。

我們使用RIP測(cè)定證實(shí)了YIYA和YIYA結(jié)合蛋白在細(xì)胞中的關(guān)聯(lián)。重組全長(zhǎng)CDK6直接與YIYA相關(guān)，但不與反義轉(zhuǎn)錄本相關(guān)。此外，CDK6的N-末端，C-末端和K43M均未顯示與YIYA的相互作用。FBXW7蛋白含有WD40結(jié)構(gòu)域，已被證明是非典型的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。FBXW7在體外以依賴于WD40結(jié)構(gòu)域的方式與YIYA相關(guān)。

免疫組織化學(xué)染色表明，與癌旁相比，CDK6蛋白在乳腺癌組織中升高。此外，在YIYA高表達(dá)的乳腺癌組織中，42例病例中超過(guò)36例CDK6表達(dá)量高; 并且63個(gè)YIYA低表達(dá)的乳腺癌組織中超過(guò)35個(gè)CDK6表達(dá)量低，表明CDK6和YIYA在乳腺癌組織中的表達(dá)之間的相關(guān)性。

為了理解YIYA相關(guān)的CDK6/cyclin-D3和SKP1/FBXW7復(fù)合物如何調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，我們使用FLAG標(biāo)記下拉然后LC-MS鑒定了與CDK6和FBXW7相關(guān)的蛋白質(zhì)。數(shù)據(jù)表明蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（ANM5，也稱為PRMT5），甲基體蛋白50（MEP50，也稱為WDR77），絲氨酸/蘇氨酸激酶38（STK38）和6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-雙磷酸酶3（F263，PFK2或PFKFB3）通常與CDK6和FBXW7相關(guān)。

接下來(lái)，我們分別確認(rèn)了CDK6，FBXW7與PRMT5，WDR77，PFKFB3和STK38之間的相互作用。我們還檢測(cè)到內(nèi)源性CDK6-STK38和CDK6-PFKFB3的相互作用。FBXW7是SCF復(fù)合物的底物識(shí)別組分，其介導(dǎo)靶蛋白的泛素化和隨后的蛋白酶體降解。FBXW7野生型（WT）的過(guò)表達(dá)降低了c-Myc蛋白水平，其被F-box結(jié)構(gòu)域缺失突變體（F突變體）阻斷，但不被PFKFB3或STK38阻斷。

我們假設(shè)CDK6-STK38和CDK6-PFKFB3相互作用可能導(dǎo)致STK38和PFKFB3的磷酸化。使用定量體外激酶測(cè)定，重組CDK6/CyclinD3復(fù)合物以劑量依賴性方式催化ATP合并重組PFKFB3和STK38。

據(jù)報(bào)道，LncRNA與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)合并可能調(diào)節(jié)其酶活性。YIYA正轉(zhuǎn)錄物但不是反轉(zhuǎn)錄物的存在增強(qiáng)了PFKFB3和STK38的CDK6依賴性磷酸化。使用定量體外激酶測(cè)定，YIYA正轉(zhuǎn)錄物的存在顯著增強(qiáng)了CDK6介導(dǎo)的PFKFB3和STK38的磷酸化。因此，我們的數(shù)據(jù)表明升高的YIYA表達(dá)水平可能促進(jìn)CDK6激酶活性并激活乳腺癌細(xì)胞中的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路。 CDK6的酶活性需要細(xì)胞周期蛋白的存在。YIYA的存在可能促進(jìn)CDK6和cyclin D3之間的關(guān)聯(lián)，導(dǎo)致PFKFB3和STK38的磷酸化增強(qiáng)。

PFKFB3催化F-2,6BP；后者變構(gòu)調(diào)節(jié)PFK1的酶活性，導(dǎo)致糖酵解增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，PFKFB3的酶活性在殘基S461處被磷酸化，其調(diào)節(jié)糖酵解。為了證實(shí)PFKFB3的CDK6依賴性磷酸化，我們產(chǎn)生了穩(wěn)定的細(xì)胞系，其中CDK6被shRNAs敲低。在CDK6敲低后，Myc標(biāo)記的PFKFB3的磷酸化降低。Myc標(biāo)記的PFKFB3野生型，T463A，S467A或T463A/S467A突變體在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)表明，當(dāng)T463和S467都突變時(shí)，外源性PFKFB3的磷酸化狀態(tài)受損。野生型PFKFB3而非T463A/S467A突變體的表達(dá)增強(qiáng)了FBP/GBP的產(chǎn)生并減少了G6P/F6P的細(xì)胞庫(kù)。這些數(shù)據(jù)表明CDK6可通過(guò)PFKFB3磷酸化調(diào)節(jié)葡萄糖代謝。

PFKFB3的YIYA/CDK6依賴性磷酸化可能在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中起關(guān)鍵作用。因此，我們使用基于13C的策略確定代謝通量。對(duì)親本和YYYA KO細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖饑餓，然后測(cè)量[U-13C]葡萄糖。與親代細(xì)胞相比，YIYA KO細(xì)胞中的細(xì)胞13C-葡萄糖攝取受損。有趣的是，在YIYA KO細(xì)胞中，我們觀察到G6P/F6P的積累和FBP/GBP的消耗，表明抑制了從F6P到FBP的轉(zhuǎn)化。一致地，YIYA的消耗導(dǎo)致甘油3磷酸和丙酮酸的產(chǎn)生受損。當(dāng)YIYA遺傳缺失時(shí)，乳酸的產(chǎn)生顯著減少。在YIYA低表達(dá)MCF7細(xì)胞中高表達(dá)YIYA顯著增強(qiáng)葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。在YIYA高表達(dá)BT474細(xì)胞中，YIYA敲低抑制葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生。此外，CDK6的敲低導(dǎo)致葡萄糖攝取減少和GBP/FBP的產(chǎn)生（圖7J和K）?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明lncRNA在調(diào)節(jié)癌癥代謝重編程和腫瘤生長(zhǎng)中可能在功能上是重要的，使得這些分子成為有吸引力的治療靶標(biāo)。

CDK6在癌癥糖酵解重編程中的分子機(jī)制一直難以捉摸?；谖覀兪占臄?shù)據(jù)，在YIYA存在下，CDK6依賴性細(xì)胞質(zhì)磷酸化事件對(duì)于促進(jìn)癌癥代謝重編程是重要的。乳腺癌中糖酵解率顯著升高，將糖酵解作為確定新的診斷策略和治療靶點(diǎn)的重要組成部分。我們的數(shù)據(jù)表明CDK6抑制劑可能阻斷乳腺癌糖酵解。

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