Identification and Functional Characterization of Long Non-coding RNA MIR22HG as a Tumor Suppressor for Hepatocellular Carcinoma

肝細(xì)胞癌腫瘤抑制因子lncRNA MIR22HG的鑒定和功能研究

    期刊：Theranostics；影響因子：8.537  

    發(fā)表單位：南方醫(yī)科大學(xué)

    之前的微文中我們介紹了如何通過lncRNA保守性尋找重要的lncRNA，如“lncRNA通過保守序列發(fā)揮作用”，lncRNA通過其衍生的miRNA發(fā)揮作用如：“lncRNA MIR100HG衍生的miR-100和miR-125b通過Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)介導(dǎo)西妥昔單抗耐藥”。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌中下調(diào)lncRNA MIR22HG表達(dá)進(jìn)而抑制其衍生的miRNA miR-22-3p，促進(jìn)靶基因HMGB1表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，MIR22HG競爭性結(jié)合HuR，使得HuR穩(wěn)定的癌基因表達(dá)減弱，進(jìn)而起到抑癌作用。

    方法：我們評估了52例患者，145例患者，TCGA和GSE14520 HCC數(shù)據(jù)中的MIR22HG表達(dá)。體外和體內(nèi)分析MIR22HG對HCC的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。通過生物信息學(xué)，熒光素酶報告基因和RNA免疫沉淀分析探索MIR22HG作用的機(jī)制。

    結(jié)果：與對照組相比，4組HCC實驗中MIR22HG表達(dá)顯著下調(diào)。其低表達(dá)與HCC患者的腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。體外和體內(nèi)HCC細(xì)胞上調(diào)表達(dá)MIR22HG顯著抑制增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移。從機(jī)理上講，MIR22HG衍生miR-22-3p以靶向基因HMGB1，從而抑制HMGB1下游途徑。另外，MIR22HG直接與HuR相互作用并調(diào)節(jié)其亞細(xì)胞定位。MIR22HG與人抗原R（HuR）競爭性結(jié)合，導(dǎo)致HuR穩(wěn)定的癌基因如β-連環(huán)蛋白的表達(dá)減弱。此外，miR-22-3p抑制，HuR或HMGB1過表達(dá)挽救了MIR22HG過表達(dá)引起的抑制作用。

    結(jié)論：我們的研究結(jié)果顯示，MIR22HG通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，這表明其在HCC中作為腫瘤抑制因子和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在作用。

    長鏈非編碼RNA參與各種生理過程，其失調(diào)與多種人類疾病相關(guān)，包括癌癥。之前的研究中，我們檢查了HCC組織和癌旁lncRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)位于17p13.3中的lncRNA NR_028502.1是一種染色體區(qū)域，在肝癌中經(jīng)常被刪除、高度甲基化或顯示出雜合性缺失，在HCC中被下調(diào)。NR_028502.1在ENCODE數(shù)據(jù)庫中被鑒定為lncRNA，并注釋為人miR-22宿主基因（MIR22HG）。然而，尚未研究MIR22HG的生物學(xué)功能。

    我們之前的微陣列分析表明，與癌旁相比，MIR22HG在HCC組織中的表達(dá)水平較低（P = 0.016）。人MIR22HG由4個轉(zhuǎn)錄物組成。我們在7對HCC組織和相應(yīng)的癌旁中檢測到這4種轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)變體1是癌旁中最豐富的同種型，但在腫瘤組織中顯著下調(diào)。因此，我們專注于變體1以獲得對MIR22HG的進(jìn)一步了解。然后我們通過qRT-PCR檢測52對HCC組織和匹配的非腫瘤組織（52名患者實驗）中的MIR22HG表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MIR22HG在HCC中顯著下調(diào)（P <0.001）。此外，來自兩個獨立HCC實驗（癌癥基因組圖譜（TCGA）和GEO登錄號GSE14520）的表達(dá)數(shù)據(jù)用于驗證（fig1）。這兩個群組中，HCC組織中MIR22HG的表達(dá)也降低（兩個群組的P <0.001）。這些發(fā)現(xiàn)證實MIR22HG在HCC中表達(dá)下調(diào)。

    為了評估MIR22HG表達(dá)的臨床意義，我們對145個人HCC組織進(jìn)行了原位雜交（ISH）。ISH測定顯示MR22HG在HCC中以低水平表達(dá)并且主要位于細(xì)胞質(zhì)中。低MR22HG表達(dá)與不良病理分級（P = 0.004），PVTT（P = 0.004）和晚期臨床分期（P = 0.005）密切相關(guān)，表明MIR22HG與HCC的臨床進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)。145例患者實驗的生存分析顯示，與低MIR22HG表達(dá)的患者相比，HCC和高MIR22HG表達(dá)的患者總生存期（OS; P = 0.001）和無病生存期（DFS; P = 0.042）表現(xiàn)更好。這一發(fā)現(xiàn)在TCGA實驗中得到驗證。此外，單變量Cox回歸分析顯示，HCC患者的死亡風(fēng)險與低MIR22HG表達(dá)顯著相關(guān)（95％），臨床分期（95％CI：1.077-3.101; P = 0.025），腫瘤復(fù)發(fā)（95％CI：1.164-3.249; P = 0.011）和腫瘤大小（95％CI：1.123-3.308; P = 0.017）。在多因素變量分析中，較低的MIR22HG表達(dá)作為HCC患者OS的獨立預(yù)后因素出現(xiàn)（95％CI：0.270-0.912; P = 0.024）。

    為了評估MIR22HG在HCC中的生物學(xué)功能，將人MIR22HG序列轉(zhuǎn)染到SK-Hep-1和SMMC-7721細(xì)胞中以穩(wěn)定表達(dá)。結(jié)果顯示MIR22HG過表達(dá)顯著降低細(xì)胞增殖能力。此外，使用小鼠皮下異種移植實驗發(fā)現(xiàn)，MIR22HG過表達(dá)SK-Hep-1和SMMC-7721細(xì)胞的腫瘤異種移植表現(xiàn)出比來自空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的腫瘤更小的體積和更低的重量。另外，在MIR22HG過表達(dá)細(xì)胞中，Ki-67（增殖標(biāo)記物）的陽性率顯著降低。這些結(jié)果證明MIR22HG在體外和體內(nèi)抑制HCC細(xì)胞增殖。另外，將特異性靶向MIR22HG的短發(fā)夾RNA引入HCC-LM3細(xì)胞以沉默MIR22HG，結(jié)果表明MIR22HG敲低促進(jìn)體外和體內(nèi)細(xì)胞增殖。在MIR22HG沉默的HCC-LM3細(xì)胞中，Ki-67的陽性率顯著增加。體外遷移和侵襲測定均顯示MIR22HG上調(diào)顯著降低SK-Hep-1和SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲（P <0.001），而MIR22HG敲低促進(jìn)了HCC-LM3細(xì)胞的遷移和侵襲。為了在體內(nèi)證實這些數(shù)據(jù)，通過尾靜脈將MIR22HG過表達(dá)的SK-Hep-1細(xì)胞和MIR22HG沉默的HCC-LM3細(xì)胞靜脈內(nèi)注射到裸鼠中。MIR22HG過表達(dá)抑制SK-Hep-1細(xì)胞向肺的轉(zhuǎn)移?？傊@些數(shù)據(jù)表明MIR22HG抑制HCC細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

    哺乳動物中含有miR-22的MIR22HG區(qū)域的高度保守性意味著miR-22的重要作用。SMMC-7721和SK-Hep-1細(xì)胞中MIR22HG的過表達(dá)明顯地增加了miR-22-3p的表達(dá)水平，而HCC-LM3細(xì)胞中MIR22HG下調(diào)顯著降低miR-22-3p的表達(dá)。為了確定該miRNA的臨床意義，我們分析了52名患者、TCGA和GSE10694實驗中的miR-22-3p表達(dá)。結(jié)果顯示，與非腫瘤組織相比，miR-22-3p在HCC組織中顯著下調(diào)。此外，miR-22-3p表達(dá)與HCC患者的OS和DFS顯著相關(guān)。

我們隨后評估了MIR22HG和miR-22-3p異常表達(dá)是否與HCC相關(guān)。在52名患者（r = 0.589; P <0.001）和TCGA（r = 0.585; P <0.001）實驗中發(fā)現(xiàn)顯著的正相關(guān)。

TCGA數(shù)據(jù)GSEA分析證明MIR22HG和miR-22-3p的表達(dá)與轉(zhuǎn)移的基因呈負(fù)相關(guān)。另外，體外遷移和侵襲測定表明miR-22-3p過表達(dá)損害了細(xì)胞遷移率和侵襲性，但是miR-22-3p敲低促進(jìn)了細(xì)胞遷移和侵襲。過表達(dá)MIR22HG的SK-Hep-1和SMMC-7721細(xì)胞中抑制miR-22-3p表達(dá)顯示敲低miR-22-3p挽救了MIR22HG過表達(dá)降低的遷移和侵襲能力。

    為了研究由MIR22HG調(diào)節(jié)的miR-22-3p的靶標(biāo)，我們使用miRanda和picTar算法進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)了一組miR-22-3p的潛在靶基因。將這些基因與肝癌中上調(diào)的基因重疊（GSE14520和GSE6762數(shù)據(jù)集），產(chǎn)生5個候選基因，包括HMGB1，CD147，TIAM1，MYCBP。然而，在miR-22-3p或MIR22HG過表達(dá)后，只有HMGB1蛋白在SMMC-7721細(xì)胞中下調(diào)。相關(guān)性分析顯示HMGB1蛋白的相對表達(dá)與20個HCC樣品中的miR-22-3p表達(dá)負(fù)相關(guān)（r = -0.454; P = 0.045）。這些發(fā)現(xiàn)表明HMGB1可能代表HCC中miR-22-3p的靶標(biāo)。

為了驗證miR-22-3p和HMGB1之間的直接相互作用，將HMGB1的3'非翻譯區(qū)（UTR）克隆到熒光素酶報告載體中，將其與miR-22-3p模擬物一起轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細(xì)胞中。為了排除非特異性結(jié)合，我們突變HMGB1的3UTR的miR-22-3p結(jié)合位點以產(chǎn)生。熒光素酶報告基因測定顯示miR-22-3p模擬物轉(zhuǎn)染顯著降低了野生型HMGB1的熒光素酶活性，但對psiCHECK-mut-HMGB1的活性沒有影響。然后我們評估HMGB1是否受MIR22HG調(diào)節(jié)。熒光素酶測定顯示MIR22HG過表達(dá)顯著降低了psiCHECK-wt-HMGB1的熒光素酶活性；然而，通過應(yīng)用miR-22-3p抑制劑挽救了這種效應(yīng)，表明MIR22HG產(chǎn)生miR-22-3p以結(jié)合HMGB1的3'UTR。

    為了鑒定MIR22HG的功能是否完全依賴于miR-22-3p，我們突變MIR22HG的miR-22-3p區(qū)域以產(chǎn)生MIR22HG-mut載體并建立過表達(dá)突變型MIR22HG的穩(wěn)定HCC細(xì)胞。miR-22-3p的表達(dá)在野生型MIR22HG過表達(dá)后增加，但在突變型MIR22HG過表達(dá)后沒有增加。另外，突變體MIR22HG顯著損害SMMC-7721細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲能力（P <0.01）。然而，突變型MIR22HG的抑制作用弱于野生型MIR22HG（P <0.01），這表明MIR22HG部分通過miR-22-3p起抑制作用。ISH和細(xì)胞質(zhì)和核RNA組分測定的結(jié)果證明MIR22HG主要位于HCC細(xì)胞和組織的細(xì)胞質(zhì)中。使用HuR光活化核糖核苷酸增強的交聯(lián)，免疫復(fù)制（PAR-CLIP; GSE28865）分析和StarBase軟件v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/rbp LncRNA.php）的生物信息學(xué)分析預(yù)測MIR22HG可能與HuR蛋白相互作用（圖6A）。因此，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）測定證實了MIR22HG和HuR之間的直接結(jié)合關(guān)系。此外，通過縮短SMMC-7721細(xì)胞中MIR22HG的半衰期，HuR敲低顯著降低MIR22HG表達(dá)。該現(xiàn)象表明HuR結(jié)合并穩(wěn)定了MIR22HG RNA。為了進(jìn)一步了解HuR和MIR22HG之間的關(guān)系，我們首先在HCC組織中檢測到HuR mRNA和MIR22HG的表達(dá)。在HuR mRNA和MIR22HG表達(dá)之間未發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)性（P = 0.334; r = 0.033）。HuR可以直接結(jié)合和控制mRNA，miRNA和lncRNA的功能。HuR靶標(biāo)包括許多致癌mRNA，例如CTNNB1，CCNB1，HIF1A，BCL2，COX2，MDM2，VEFGA和C-FOS。RIP測定證實HuR直接與這些mRNA結(jié)合。RIP分析表明，在MIR22HG存在下，MIR22HG和HuR之間的結(jié)合顯著增加，從而降低了HuR與癌基因（包括CTNNB1，CCNB1，HIF1A，BCL2，COX2和C-FOS）的結(jié)合能力，但不是MDM2和VEGFA?？偟膩碚f，我們的數(shù)據(jù)表明HuR可能在MIR22HG介導(dǎo)的腫瘤抑制中起關(guān)鍵作用。

    據(jù)我們所知，這是第一次研究MIR22HG在癌癥中的生物學(xué)功能的研究。強有力的證據(jù)表明，與基于4個實驗的非腫瘤肝組織相比，MIR22HG在HCC組織中以低水平表達(dá)。我們的結(jié)果顯示低MIR22HG表達(dá)與腫瘤進(jìn)展相關(guān)，并且MIR22HG表達(dá)代表HCC患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子。功能上，MIR22HG過表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，我們的數(shù)據(jù)表明MIR22HG表達(dá)是控制人類HCC進(jìn)展的重要因素。MIR22HG通過衍生miR-22-3p和競爭性結(jié)合HuR來抑制HCC細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致多種癌基因的下調(diào)和HMGB1信號傳導(dǎo)的失活。我們還發(fā)現(xiàn)MIR22HG可以調(diào)節(jié)HuR亞細(xì)胞定位。我們的研究結(jié)果支持lncRNA在HCC中的關(guān)鍵作用可能會確定治療HCC的新治療靶點。

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