The human lncRNA LINC-PINT inhibits tumor cell invasion through a highly conserved sequence element

人lncRNA LINC-PINT通過高度保守的序列元件抑制腫瘤細(xì)胞侵襲

期刊：Genome Biology；影響因子：13.214  

發(fā)表單位：納瓦拉大學(xué)

LncRNA保守性比較低，但部分序列仍是多物種保守的。這種保守序列與其功能密切相關(guān)，從保守序列入手或許是尋找重要功能lncRNA的一個(gè)好辦法。此前介紹過三篇挑選超保守區(qū)域lncRNA，進(jìn)行功能研究的文章“RNAseq得到差異lncRNA那么多，該如何找到需要的lncRNA?”，超保守lncRNA在癌/睪丸中結(jié)合IGF2BP1形成復(fù)合物調(diào)控靶標(biāo)基因（cell, IF:31.398）；“根據(jù)保守性挑選重要功能lncRNA”，lncRNA抑制miRNA生成促進(jìn)靶基因表達(dá)（Gastroenterology, IF:20.773）；“超保守lncRNA驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪積累”，lncRNA抑制miRNA成熟（nature communications, IF:12）。本研究發(fā)現(xiàn)LINC-PINT在多物種中保守，并在多種癌組織/癌細(xì)胞中下調(diào)，可抑制癌細(xì)胞侵襲。其發(fā)揮作用是通過高保守區(qū)序列實(shí)現(xiàn)的。

LncRNA保守性比較低，但部分序列仍是多物種保守的。這種保守序列與其功能密切相關(guān)，許多lncRNAs可以調(diào)節(jié)基因功能和基因表達(dá)。主要挑戰(zhàn)之一是鑒定lncRNA功能序列元件。lncRNAs的一個(gè)獨(dú)特特征是它們物種保守性相對(duì)較低。許多人類lncRNAs不存在于其他生物體中，而其他生物體雖然在其他物種中發(fā)現(xiàn)，但其序列保守程度有限。這些序列可能包含其功能所需的元件。本研究鑒定到 LINC-PINT在癌癥中充當(dāng)抑癌因子，其保守序列發(fā)揮主要作用。

之前研究，我們鑒定小鼠Linc-pint是由p53誘導(dǎo)的lncRNA，其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。人同源轉(zhuǎn)錄本LINC-PINT也受p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在TP53突變的腫瘤中，LINC-PINT的表達(dá)降低。我們還觀察到，結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中LINC-PINT的表達(dá)降低。結(jié)直腸癌細(xì)胞系中LINC-PINT的表達(dá)降低。TCGA分析顯示LINC-PINT在幾種癌癥類型中顯著降低，包括乳腺，子宮內(nèi)膜和肺鱗狀細(xì)胞癌等。而較低水平的RNA與患者的存活率降低顯著相關(guān)，表明LINC-PINT表達(dá)與腫瘤侵襲性之間呈負(fù)相關(guān)（fig1）。

首先，我們?cè)诮Y(jié)直腸癌（HCT116）和肺腺癌細(xì)胞系（A549）高表達(dá)LINC-PINT。RNA-FISH顯示LINC-PINT定位于細(xì)胞核中，與內(nèi)源lncRNA相似。免疫缺陷小鼠過表達(dá)LINC-PINT，形成腫瘤的能力下降，表明LINC-PINT抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲性。

我們進(jìn)一步研究了幾種癌細(xì)胞系中LINC-PINT的高表達(dá)的表型。LINC-PINT抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移和侵襲能力的顯著下降。敲低LINC-PINT導(dǎo)致細(xì)胞的侵襲能力增加。

使用小鼠肝轉(zhuǎn)移模型測(cè)試LINC-PINT是否也能夠抑制體內(nèi)細(xì)胞侵襲。 雖然對(duì)照和LINC-PINT細(xì)胞都能夠轉(zhuǎn)移到肝臟，但在LINC-PINT過表達(dá)細(xì)胞中，大轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少。結(jié)果表明LINC-PINT不僅抑制細(xì)胞在體外侵入的能力，而且還降低了體內(nèi)細(xì)胞的植入潛力。

LINC-PINT在整個(gè)哺乳動(dòng)物、鳥類中具有序列相似的同源轉(zhuǎn)錄本。此外，我們發(fā)現(xiàn)p53對(duì)LINC-PINT的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在小鼠和人之間是保守的。小鼠Lincpint在人類細(xì)胞中的高表達(dá)與人類lncRNA具有相似的作用。我們推斷LINC-PINT的活性依賴于保守的RNA序列。實(shí)際上，鼠和人轉(zhuǎn)錄本之間的序列比較分析顯示在人LINC-PINT的核苷酸535和924之間的區(qū)域中具有高度同源性（e值2.00E-74）。為了測(cè)試lncRNA的這個(gè)區(qū)域的功能，我們產(chǎn)生了截短形式的LINC-PINT。與全長(zhǎng)LINC-PINT相比，低保守區(qū)對(duì)HCT116細(xì)胞的入侵能力或增殖沒有影響。高保守區(qū)可以將侵入性降低到甚至低于全長(zhǎng)LINC-PINT的水平，表明LINC-PINT的這個(gè)保守區(qū)足以發(fā)揮作用。

我們將LINC-PINT跨物種分析擴(kuò)展到17種哺乳動(dòng)物。比較分析鑒定了LINC-PINT功能性HCR內(nèi)的幾個(gè)短保守元件。我們對(duì)這些序列進(jìn)行了不同的缺失，產(chǎn)生了缺少CE1的ΔCE1突變體，實(shí)驗(yàn)表明缺乏CE1完全消除了LINC-PINT的作用和腫瘤形成。

   LINC-PINT的功能獲得對(duì)癌細(xì)胞的侵襲能力具有強(qiáng)烈影響。為了確定所涉及的細(xì)胞途徑，我們過表達(dá)并通過微陣列進(jìn)行基因表達(dá)分析。其中233上調(diào)和301下調(diào)。差異基因富集到不同的生物學(xué)功能，最重要的是細(xì)胞發(fā)育，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。詳細(xì)分析腫瘤細(xì)胞粘附網(wǎng)絡(luò)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞遷移能力相關(guān)幾個(gè)基因下調(diào)，如早期生長(zhǎng)反應(yīng)1（EGR1），磷脂酶D1（PLD1），白血病抑制因子（LIF） ，FBJ骨肉瘤癌基因（FOS），SERPINE1，纖連蛋白1（FN1）或整合素α3（ITGA3）。這些基因表達(dá)變化與細(xì)胞增殖和侵襲能力的降低一致，通過qRT-PCR獨(dú)立驗(yàn)證。

我們研究LINC-PINT如何導(dǎo)致侵襲基因下調(diào)。有趣的是，當(dāng)小鼠Lincpint在人體細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，這種特征的幾個(gè)基因也被下調(diào)，表明它們的抑制是由小鼠和人類形式共有的機(jī)制引起的。之前已經(jīng)證明，LINC-PINT的小鼠轉(zhuǎn)錄本與PRC2相互作用，并且它是通過這種蛋白質(zhì)復(fù)合物有效靶向和抑制基因所必需的。然后我們通過檢測(cè)PRC2免疫沉淀物中LINC-PINT的特異性富集，證實(shí)LINC-PINT和PRC2在不同起源的人細(xì)胞中相互作用，包括正常細(xì)胞系和癌細(xì)胞系。我們假設(shè)LINC-PINT的活動(dòng)可能至少部分與PRC2有關(guān)。然后，我們研究了由LINC-PINT誘導(dǎo)的這些基因所觀察到的表達(dá)變化是否由PRC2介導(dǎo)。為了測(cè)試這一點(diǎn)，我們通過使用針對(duì)復(fù)合物的催化亞基EZH2的shRNA抑制LINC-PINT過表達(dá)HCT116細(xì)胞中PRC2的表達(dá)，并通過qRT-PCR分析了幾種基因的表達(dá)，大多數(shù)基因的表達(dá)水平由PRC2敲低誘導(dǎo)，表明它們通過LINC-PINT的沉默是PRC2依賴性的。 ChIP-qPCR顯示當(dāng)LINC-PINT高表達(dá)時(shí)SUZ12與所有啟動(dòng)子的結(jié)合顯著增加。伴隨著PRC2占據(jù)的增加，幾乎所有分析的基因啟動(dòng)子（6/8）都顯示出PRC2催化的表觀遺傳修飾H3K27me3的水平顯著增加。總之，結(jié)果表明LINC-PINT與PRC2共同作用以提高參與細(xì)胞侵襲基因的表達(dá)。

接下來，為了研究與PRC2的相互作用涉及LINC-PINT的哪個(gè)區(qū)域，我們?cè)谂c甲醛（fRIP）交聯(lián)并結(jié)合RNA組分后應(yīng)用RIP。我們觀察到CE1區(qū)域引物定位的最高濃度，表明LINC-PINT的這一部分介導(dǎo)其與PRC2的相互作用。最后，我們進(jìn)一步測(cè)試了LINC-PINT在體外結(jié)合PRC2的能力是否依賴于CE1序列。為此，我們合成了LINC-PINT的不同突變形式，以及FL LINC-PINT和反義全長(zhǎng)作為對(duì)照。結(jié)果證實(shí)，盡管高保守區(qū)是測(cè)試的RNA突變體中最短的，但全長(zhǎng)LINC-PINT和高保守區(qū)突變體以最高親和力結(jié)合PRC2。

我們的數(shù)據(jù)顯示LINC-PINT（HCR）的截短序列包含抑制癌細(xì)胞遷移所必需的所有元素。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)短序列motif（CE1），它在哺乳動(dòng)物中高度保守并且是LINC-PINT功能所必需的。

我們的研究結(jié)果證明了LINC-PINT在癌癥進(jìn)展和腫瘤惡性腫瘤中下調(diào)。此外，它們支持LINC-PINT和PRC2之間保守的功能性共依賴性，其抵消EGR1對(duì)基因的激活。它引導(dǎo)我們提出一種新的機(jī)制，lncRNA調(diào)節(jié)特定基因組區(qū)域附近的PRC2的可用性，表明lncRNA和DNA結(jié)合蛋白之間的相互作用可能與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用相關(guān)。

其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀：nature communications：超保守lncRNA驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪積累（IF:12）

文獻(xiàn)解讀：根據(jù)保守性挑選重要功能lncRNA（Gastroenterology，IF:20.773）

文獻(xiàn)解讀：Science：lncRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝促進(jìn)病毒增殖

文獻(xiàn)解讀：Nature medicine：EGFR同義突變引起靶向藥耐藥是由lncRNA EGFR-AS1介導(dǎo)的 （IF：32.621）

文獻(xiàn)解讀：腫瘤耐藥中l(wèi)ncRNA, miRNA是怎么發(fā)揮作用的呢

文獻(xiàn)解讀：RNAseq得到差異lncRNA那么多，該如何找到需要的lncRNA?

文獻(xiàn)解讀：肝癌干細(xì)胞基因間lncTCF7 cis 調(diào)控臨近基因表達(dá)