An interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism

文字：[大][中][小] 2018/10/26 瀏覽次數(shù)：

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An interferon-independent lncRNA promotes viral replication by modulating cellular metabolism

不依賴于干擾素的lncRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝來促進病毒復(fù)制

期刊：Science；影響因子：41.058

發(fā)表單位：第二軍醫(yī)大學(xué)

導(dǎo)讀

病毒感染宿主細(xì)胞會調(diào)節(jié)宿主代謝網(wǎng)絡(luò)以創(chuàng)造利于病毒生長和復(fù)制的條件。這種調(diào)控可以通過IFN-1/IRF3途徑進行，在這個過程中l(wèi)ncRNA是怎樣參與的，了解很少。本研究通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1表達量異常，敲低時病毒生存和繁殖能力下降，臨近基因分析未找到cis調(diào)控基因。ChIRP實驗獲取結(jié)合蛋白，并做質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ACOD1可以與代謝酶GOT2（GOT2表達水平?jīng)]有變化）結(jié)合進而調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)，促進病毒增殖。

1 摘要

病毒調(diào)節(jié)宿主代謝網(wǎng)絡(luò)以改善其生存條件。然而，對病毒感染后宿主產(chǎn)生反應(yīng)的分子有哪些，是如何調(diào)節(jié)這種代謝變化的，對于理解病毒感染是必不可少的。在這里，我們鑒定了由多種病毒誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的lncRNA，不是由I型干擾素（IFN-1）誘導(dǎo)的，該lncRNA促進小鼠和人細(xì)胞中的病毒復(fù)制。lncRNA-ACOD1敲低通過IFN-1/IRF3非依賴性途徑顯著減弱病毒感染。細(xì)胞質(zhì)lncRNA-ACOD1直接結(jié)合基質(zhì)壁附近的代謝酶谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT2），增強其催化活性。重組GOT2蛋白及其代謝物可以在lncRNA-ACOD1敲低后挽救病毒復(fù)制并增加致死率。這項工作揭示了病毒誘導(dǎo)的lncRNA介導(dǎo)的病毒感染促進代謝的反饋方式，為開發(fā)廣譜抗病毒療法提供潛在目標(biāo)。

2 研究背景

代謝是所有生物過程的能量和材料的來源。繁殖型病毒感染需要改變宿主細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)以獲得病毒生命周期的材料。正鏈RNA病毒和包膜病毒改變脂質(zhì)代謝增強復(fù)制能力，丙型肝炎病毒（HCV）在肝細(xì)胞中引發(fā)類似谷氨酰胺的代謝。盡管一些宿主和病毒編碼的microRNA已被證明可部分介導(dǎo)這些代謝途徑的改變，但所涉及的分子機制仍然了解很少，特別是病毒如何靶向和調(diào)節(jié)宿主代謝網(wǎng)絡(luò)以進行復(fù)制并逃避宿主防御。在哺乳動物基因組中已經(jīng)鑒定了數(shù)以千計的長非編碼RNA（lncRNA），其中只研究了少數(shù)，但越來越多地lncRNA在不同的過程和疾病的功能得以鑒定，包括感染，先天性和適應(yīng)性免疫。干擾素，尤其是I型干擾素（IFN-I），是通過激活干擾素刺激的基因（ISG）來控制病毒感染的重要細(xì)胞因子。盡管已經(jīng)報道了一些宿主lncRNA來調(diào)節(jié)ISG的表達或受病毒感染中的干擾調(diào)節(jié)，但我們對感染細(xì)胞中lncRNA功能的了解仍然非常有限，特別是關(guān)于病毒劫持宿主主宰復(fù)制的機制。目前，報道的lncRNA功能模式主要集中在調(diào)節(jié)細(xì)胞核中基因表達和影響細(xì)胞質(zhì)中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或吸附microRNA。然而，lncRNAs其他作用方式仍然存在。是否存在其他未知的lncRNA調(diào)控機制需要進一步探索。

3 結(jié)果

為了研究lncRNAs在病毒感染中的作用以及與IFN-I系統(tǒng)的關(guān)系，我們分析了野生型（WT）和IFN-1受體缺陷型（Ifnar^{- /-}）巨噬細(xì)胞中在有或沒有水皰性口炎病毒（VSV）感染時lncRNA表達。有趣的是，我們鑒定了一組病毒誘導(dǎo)的IFN-I非依賴性lncRNA：病毒感染誘導(dǎo)其表達而不在意IFN-1受體缺陷，而單獨的IFN-I刺激也不能誘導(dǎo)它們的表達（圖S1A）。通過對這些IFN-I非依賴性lncRNA進行RNA干擾（RNAi）介導(dǎo)的功能實驗，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞中的病毒滴度在基因間lncRNA的敲低時顯著下調(diào)（Gene Symbol LOC102637961）（圖S1B），其最近的編碼基因是ACOD1，下文稱為lncRNA-ACOD1。我們證實lncRNA-ACOD1可以被獨立于IFN-1的許多類型的病毒刺激（圖1A），與IFN-1依賴性lncRNA LOC625033（圖S1C）相反。此外，在檢測到的大多數(shù)細(xì)胞和器官中，lncRNA-ACOD1由病毒感染誘導(dǎo)（圖1，B和C）。通過Northern印跡確認(rèn)具有poly（A）尾的lncRNA-ACOD1表達（圖1D）。cDNA末端的快速擴增（RACE）和RNA測序數(shù)據(jù)顯示它具有三個外顯子和兩個轉(zhuǎn)錄物變體（2330和2259個核苷酸）（圖S2，A至C）。lncRNA-ACOD1具有中等表達水平，每個細(xì)胞約100個轉(zhuǎn)錄本拷貝（圖S2D），并且我們的核糖體分析數(shù)據(jù)顯示它具有非常低的核糖體占據(jù)（圖1E），表明lncRNA-ACOD1缺乏編碼潛力。

轉(zhuǎn)錄因子IRF3在IFN-I的產(chǎn)生和病毒感染功能中起著至關(guān)重要的作用。使用Irf3^-/-或Ifnar1^-/-細(xì)胞和小鼠，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1表達獨立于IRF3/IFN-1信號傳導(dǎo)（圖S3）。然而，我們的藥理學(xué)抑制劑測定顯示，lncRNA-ACOD1表達很大程度上依賴于核因子-κB（NF-κB）（圖S4A），這是一種參與多種細(xì)胞過程的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物，包括細(xì)胞代謝和炎癥。因此，我們在lncRNA-ACOD1啟動子序列中鑒定了NF-κB復(fù)合物RelA的三個結(jié)合位點。然后將具有或不具有RelA motif突變的啟動子區(qū)域克隆到螢火蟲熒光素酶編碼區(qū)的上游（圖S4，B和C，左）。熒光素酶表達僅在存在野生型RelA motif時高，并且可以通過RelA過表達進一步增強（圖S4，B和C，右），表明NF-κB而非IRF3/IFN-I參與誘導(dǎo)lncRNA-ACOD1。

接下來，我們研究了lncRNA-ACOD1在病毒感染中的作用。我們發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA-ACOD1（圖2A）顯著降低了巨噬細(xì)胞中的VSV含量（圖2，B和C）。病毒含量的減少不是由于宿主先天免疫反應(yīng)增強，因為IFN-1和IL6的產(chǎn)生和有效基因表達水平也因lncRNA-ACOD1的敲低而降低（圖S5）。在另外兩種病毒感染，DNA病毒單純皰疹病毒1型（HSV-1）和痘苗病毒（VACV）（圖S6）中也觀察到類似的病毒含量和先天反應(yīng)的減少，表明lncRNA-ACOD1促進了病毒感染。我們在病毒進入時進行瞬時感染測定，并顯示lncRNA-ACOD1對病毒進入沒有影響（圖S7A）。然后我們利用紫外線照射VSV（UV-VSV），它可以感染細(xì)胞但不會增殖，poly (I：C) 是病毒RNA的模擬刺激，刺激細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1對UV-VSV和poly（I：C）反應(yīng)沒有影響（圖S7，B和C），表明lncRNA-ACOD1在宿主細(xì)胞中的病毒復(fù)制階段起作用。此外，我們利用CRISPR-Cas9敲除巨噬細(xì)胞系RAW264.7中的lncRNA-ACOD1并獲得了類似的結(jié)果（圖S8），進一步證實了lncRNA-ACOD1對病毒復(fù)制至關(guān)重要。

為了探索lncRNA-ACOD1在體內(nèi)的作用，我們構(gòu)建了lncRNA-ACOD1敲除小鼠（圖S9，A和B）。我們發(fā)現(xiàn)體內(nèi)VSV復(fù)制在lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中顯著降低（圖2，D和E），同時病理改變減弱（圖2F和圖9C）并且免疫先天反應(yīng)減弱（圖9，D和E）。此外，所有lncRNA-ACOD1缺陷小鼠在用致死劑量的VSV感染攻擊時存活，而大多數(shù)同胞對照死亡（圖2G）。我們還使用病毒性動脈內(nèi)感染模型來測試體內(nèi)lncRNA-ACOD1功能并觀察到類似的結(jié)果（圖S10）。在人類中，lncRNA-ACOD1同源轉(zhuǎn)錄本也因甲型流感/PR/8/34病毒（PR8）對病毒感染的反應(yīng)而上調(diào)，其通過RNAi敲低導(dǎo)致A549人肺泡基底上皮細(xì)胞的病毒含量降低（圖S11），表明lncRNA-ACOD1在促進病毒復(fù)制中的功能至少在人和小鼠中是保守的。

由于lncRNA-ACOD1表達獨立于IFN-I/IRF3，我們分析了lncRNA-ACOD1功能是否也與體內(nèi)IFN-I/IRF3無關(guān)。因此，我們通過用Ifnar1^-/-小鼠或Irf3^-/-小鼠繁殖lncRNA-ACOD1缺陷小鼠來產(chǎn)生雙敲除小鼠。我們發(fā)現(xiàn)，在沒有IFN-1信號傳導(dǎo)的情況下，lncRNA-ACOD1的缺乏導(dǎo)致VSV增殖的顯著抑制以及減輕的免疫應(yīng)答（圖2，H和I，以及圖S12，A和B）和顯著降低致死率（圖2，J和K）。因此，我們提出lncRNA-ACOD1可能通過新的機制而不是經(jīng)典的IRF3/ IFN-I途徑促進病毒復(fù)制。

為了試探lncRNA-ACOD1是否通過細(xì)胞凋亡和自噬發(fā)揮作用，據(jù)報道它們參與了病毒清除，我們用流式細(xì)胞儀和免疫印跡法檢測了lncRNA-ACOD1的作用，發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞凋亡和自噬沒有受lncRNA-ACOD1的影響（圖S13）。然后我們試探了lncRNA-ACOD1是否以順式作用，影響附近的基因表達（圖S14A）。我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1的敲低或缺乏不會影響附近基因的表達（圖S14，B和C），反之亦然（圖S14D）。我們接下來檢查細(xì)胞中lncRNA-ACOD1的位置。對核/細(xì)胞質(zhì)組分進行RNA熒光原位雜交（FISH）和反轉(zhuǎn)錄RT-PCR（圖S15），表明它位于細(xì)胞質(zhì)中，表明它可能與細(xì)胞質(zhì)分子或蛋白質(zhì)相互作用。

為了獲得lncRNA-ACOD1機制的線索，我們進行了微陣列轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1缺陷導(dǎo)致許多代謝相關(guān)基因的表達水平發(fā)生變化（此處做了lncRNA-ACOD1敲低，然后高通量篩選尋找靶基因）（圖S16A）。途徑富集分析顯示代謝途徑是受lncRNA-ACOD1缺失影響的最重要途徑（圖S16，B和C），表明lncRNA-ACOD1在病毒感染期間在代謝調(diào)節(jié)中的可能作用。因此，我們使用液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進行了全代謝組學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示病毒感染導(dǎo)致WT細(xì)胞的大量代謝變化，這被lncRNA-ACOD1缺乏所消除，如圖所示。鑒定中間體的負(fù)離子/正離子的簇圖（圖S17）。

為了在體內(nèi)搜索lncRNA-ACOD1相互作用分子，我們使用修飾的ChIRP純化內(nèi)源性lncRNA-ACOD1復(fù)合物。在確認(rèn)選擇性地檢測到lncRNA-ACOD1而不是U6 RNA和ACTB mRNA后（圖S18），通過凝膠電泳分離lncRNA-ACOD1相關(guān)蛋白并通過質(zhì)譜（MS）鑒定。GOT2是一種參與許多過程的關(guān)鍵代謝酶，包括氨基酸代謝，長鏈脂肪酸攝取和三羧酸循環(huán)，被鑒定為lncRNA-ACOD1結(jié)合蛋白，經(jīng)獨立免疫印跡法進一步證實（圖3A）。在天然條件下使用GOT2特異性抗體（Native RIP）和紫外交聯(lián)條件（UV-CLIP）的RNA免疫沉淀（RIP）測定均顯示lncRNA-ACOD1，但不是其他測試的RNA，在GOT2抗體中高度富集的復(fù)合物與免疫球蛋白G（IgG）檢測的樣品相比，驗證了小鼠和人的相互作用的特異性（圖3B和圖S19）。而我們的亞細(xì)胞組分 - 比如進一步顯示它們的相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)而不是線粒體中（圖S20）。 lncRNA-ACOD1和GOT2的解離常數(shù)為1.51±0.05×10-8M（圖S21）。我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1對GOT2表達水平?jīng)]有影響（圖S22）。

然后我們檢查了lncRNA-ACOD1是否通過GOT2起作用。排除了對細(xì)胞活力或其他重要過程的可能作用后（圖S23），我們發(fā)現(xiàn)GOT2敲除顯著降低了VSV復(fù)制（圖3，C和D）和免疫應(yīng)答（圖S24，A和B），lncRNA-ACOD1在病毒感染中表達量下降。并且我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1過表達促進對照細(xì)胞中的病毒復(fù)制和免疫應(yīng)答，而對GOT2敲低細(xì)胞沒有影響（圖3E和圖S2和S4C），表明GOT2的敲低阻斷了lncRNA-ACOD1活性。此外，用重組活性GOT2補充細(xì)胞挽救了lncRNA-ACOD1敲低（圖3F）和GOT2敲低（圖3G）的作用以促進病毒復(fù)制。基于這些數(shù)據(jù)，我們提出病毒誘導(dǎo)的lncRNA-ACOD1通過直接結(jié)合代謝酶GOT2促進病毒復(fù)制。

通過適應(yīng)的eCLIP印跡GOT2復(fù)合物的RNA測序揭示了與GOT2相互作用的lncRNA-ACOD1 5'端的區(qū)段（核苷酸165至390）（圖4A）。然后使用全長或5'結(jié)合位點缺失的lncRNA-ACOD1來處理lncRNA-ACOD1敲除巨噬細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)GOT2結(jié)合位點依賴性拯救病毒復(fù)制（圖S25）。GOT2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度保守，具有大結(jié)構(gòu)域，小結(jié)構(gòu)域和氨基末端尾部（圖4B上部）。兩個GOT2蛋白質(zhì)分子形成生物同源二聚體，兩個同源二聚體構(gòu)建不對稱單元，催化代謝物之間的可逆轉(zhuǎn)氨作用，如草酰乙酸和L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為L-天冬氨酸和α-酮戊二酸。為了解lncRNA-ACOD1如何影響GOT2功能，我們通過在蛋白酶消化的lncRNA-ACOD1復(fù)合物中結(jié)合肽MS鑒定研究了GOT2的哪一部分與lncRNA-ACOD1相互作用，我們發(fā)現(xiàn)了15個殘基的肽（殘基54-68）來自GOT2的小結(jié)構(gòu)域作為lncRNA-ACOD1的結(jié)合位點（圖4B，mid-dle），其在脊椎動物中相對高度保守（圖4B，下圖）。使用完整或片段缺失的GOT2，我們的RIP測定證實這15個殘基區(qū)域?qū)τ?/span>lncRNA-ACOD1結(jié)合是關(guān)鍵的（圖4C）。

在結(jié)構(gòu)上，結(jié)合肽在空間上接近底物位點（Gly65殘基和之間的4.2?）（圖S26），表明lncRNA-ACOD1可能影響GOT2的酶活性。為了驗證這一假設(shè)，我們使用純化的GOT2蛋白和T7轉(zhuǎn)錄的lncRNA，在體外進行酶促反應(yīng)的動力學(xué)測定。通過HPLC-MS檢測L-天冬氨酸輸出的速率，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1增強了GOT2的催化活性，這取決于其5'結(jié)合位點，如圖所示的kcat值（圖4D）。此外，我們還嘗試檢查lncRNA-ACOD1對體內(nèi)GOT2活性的影響。我們發(fā)現(xiàn)GOT2代謝物L-天冬氨酸和α-酮戊二酸在代謝物靶向LC/MS檢測中的lncRNA-ACOD1缺陷小鼠（圖4E）以及我們的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)（表S1）中顯著降低，表明GOT2體內(nèi)lncRNA-ACOD1缺乏會抑制酶活性。然后，我們檢查了GOT2代謝物是否可以挽救lncRNA-ACOD1缺陷小鼠中抑制的病毒復(fù)制。我們在VSV攻擊前用L-天冬氨酸或α-酮戊二酸腹膜內(nèi)補充到lncRNA-ACOD1^-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)它們促進體內(nèi)病毒復(fù)制并增加致死率（圖4，F和G）?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，病毒感染誘導(dǎo)的lncRNA-ACOD1反饋通過促進GOT2催化活性及其代謝產(chǎn)物促進病毒復(fù)制。

雖然在系統(tǒng)方法中已將代謝酶鑒定為潛在的RNA結(jié)合蛋白，但對其功能相關(guān)性和分子機制知之甚少。我們發(fā)現(xiàn)氨基轉(zhuǎn)移酶GOT2與病毒誘導(dǎo)的lncRNA-ACOD1在空間上最接近底物生態(tài)位的最保守的15-殘基部分相互作用，通過模擬GOT2活性及其代謝產(chǎn)物，lncRNA-ACOD1促進病毒復(fù)制和感染。與報告的lncRNA機制模型相比，我們通過NF-κB而非IFN-I途徑鑒定了病毒感染誘導(dǎo)的lncRNA，其通過代謝酶結(jié)合機制起作用以促進病毒感染。這代表了病毒利用宿主代謝網(wǎng)絡(luò)進行生存的新方法，提供了對代謝調(diào)節(jié)和病毒感染的洞察，這可能與涉及代謝功能障礙和病毒感染的臨床疾病有關(guān)，其中lncRNA-ACOD1可能是干預(yù)的有用目標(biāo)。

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