Long noncoding RNA EGFR-AS1 mediates epidermal growth factor receptor addiction and modulates treatment response in squamous cell carcinoma

長鏈非編碼RNA EGFR-AS1介導(dǎo)表皮生長因子受體敏感度并調(diào)節(jié)鱗狀細(xì)胞癌的治療響應(yīng)

期刊：Nature medicine；影響因子：32.621

發(fā)表單位：新加坡國家癌癥中心癌癥治療研究實驗室

導(dǎo)讀

通過靶向EGFR腫瘤藥物治療鱗狀細(xì)胞癌是一個有效的辦法，但仍有很大一部分患者對藥物的敏感程度不高，本研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因同義SNP突變影響著藥物敏感性，同義SNP可以調(diào)節(jié)lncRNA EGFR-AS1的表達(dá)，EGFR-AS1影響EGFR同基因不同轉(zhuǎn)錄本D與A表達(dá)比率，同基因不同轉(zhuǎn)錄本介導(dǎo)配體驅(qū)動的EGFR敏感度，進(jìn)而引起對藥物反應(yīng)的差異。

1摘要

靶向EGFR是治療鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的有效方法，盡管尚無確定的生物標(biāo)志物用于預(yù)測效果。我們已經(jīng)確定EGFR的同義突變，c.2361G> A（編碼p.Gln787Gln），兩名頭頸部SCC（HNSCC）患者是吉非替尼的特殊響應(yīng)者，我們在患者來源的培養(yǎng)物中顯示與G/A和G/G基因型相比，基因型A/A與酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的更高敏感性相關(guān)。值得注意的是，單拷貝G> A等位基因模型中的核苷酸編輯由于EGFR-AS1長非編碼RNA（lncRNA）的表達(dá)量降低而使靈敏度提高了70倍。在適當(dāng)?shù)谋尘跋?，靈敏度可以通過體外和體內(nèi)EGFR-AS1敲低重現(xiàn)，而過表達(dá)足以誘導(dǎo)對TKI的抗性。EGFR-AS1水平降低使剪接轉(zhuǎn)向EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D，導(dǎo)致配體介導(dǎo)的通路激活。在涉及患者和患者衍生的異種移植物（PDX）模型的共同臨床試驗中，腫瘤縮小在EGFR-Q787Q的A/A基因型，EGFR-AS1的低表達(dá)和EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D的高表達(dá)的背景下最明顯。我們的研究揭示了“同義”突變?nèi)绾斡绊?/span>lncRNA的水平，導(dǎo)致非典型的EGFR敏感度，并描繪了一種新的用于響應(yīng)EGFR TKI預(yù)測生物標(biāo)志物。

2 研究背景

表皮生長因子受體（EGFR）-途徑-導(dǎo)向的治療學(xué)已證實在HNSCCs中的臨床效果，其中已觀察到治療結(jié)果的位點特異性差異。口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是HNSCC的一個亞組，具有不斷變化的分子和統(tǒng)計學(xué)特征，包括人乳頭瘤病毒（HPV）陽性率低和不吸煙者比例增加。盡管多方法治療已經(jīng)有了實質(zhì)性的改進(jìn)，但接受此類治療的患者中只有50％得到治愈。迄今為止，鉑類化療治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的患者治療選擇有限，總生存時間中值為6-9個月。盡管無可辯駁的證據(jù)表明一部分HNSCC依賴于EGFR信號傳導(dǎo)，但通過單克隆抗體和/或TKIs治療僅取得了中等成功。在轉(zhuǎn)移性環(huán)境中，西妥昔單抗單藥治療的響應(yīng)率為13％; EGFR TKIs在多個2期試驗中的療效差異很大，響應(yīng)率為1.8-20％。

靶向治療的成功取決于高精度生物標(biāo)志物預(yù)測的使用。HNSCC中的基于群組的測序研究和OSCC中的亞群分析未能證明在EGFR或其他候選生物標(biāo)記的外顯子18-21中激活突變的預(yù)測潛力（例如，EGFR擴(kuò)增）對抗EGFR療法的反應(yīng)，提示一部分腫瘤通過未知的非基因組機(jī)制仍然依賴于EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一項完成的2期試驗中，我們檢測了吉非替尼聯(lián)合放化療治療不能切除的OSCC的作用，我們記錄了在單藥治療的最初4周內(nèi)接受吉非替尼治療的兩名患者的顯著反應(yīng)。在這兩種情況下，靶向EGFR測序均未顯示“激活”突變或擴(kuò)增。然而，在這兩位患者中，我們在EGFR外顯子20的編碼位置2361（A/A而不是野生型G/G）中鑒定出同義純合單核苷酸變體。該變體先前已在HNSCC細(xì)胞系中描述，其中在該位置具有異源G/A與G/G（野生型）基因型的細(xì)胞中觀察到增加的吉非替尼敏感性。

基于觀察到EGFR-Q787Q（SNP ID，rs10251977; c.2361G> A）與gefit-inib的臨床反應(yīng)相關(guān)，我們首次根據(jù)我們的知識描述EGFR中的沉默SNP如何賦予對EGFR TKI的敏感性。這種敏感性源于SNP調(diào)節(jié)lncRNA EGFR-AS1轉(zhuǎn)錄的作用，這決定了EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)比例，而EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本又反過來介導(dǎo)配體驅(qū)動的EGFR敏感度。

3 結(jié)果

1 患者來源的口腔鱗狀細(xì)胞癌原代培養(yǎng)物中EGFR外顯子20的沉默多態(tài)性介導(dǎo)的TKIs的差異敏感性

先前在我們實驗室建立的6個患者來源的原代培養(yǎng)細(xì)胞系測試了對EGFR抑制劑吉非替尼和厄洛替尼的敏感性（圖1a和補(bǔ)充表1）。如圖所示，六種原代細(xì)胞系中有四種對EGFR抑制不敏感，而NCC-HN19和NCC-HN64在治療范圍內(nèi)始終表現(xiàn)出半數(shù)最大抑制濃度（IC₅₀）值（吉非替尼和厄洛替尼分別是0.07和0.26M）。靶向重測序未檢測到致敏EGFR突變或揭示藥物敏感性與EGFR拷貝數(shù)之間的任何相關(guān)性（補(bǔ)充圖1a）。相反，在上述2期試驗（SNP ID，rs10251977; c.2361G> A; p.Gln787Gln）中鑒定的相同同義SNP中，兩條敏感品系對于A等位基因是純合的，而對于該SNP，純合野生型（G/G）或雜合（G/A）（補(bǔ)充圖1b）抗性增加。從15分鐘到48小時的時程實驗確定16小時是比較細(xì)胞系之間的途徑信號傳導(dǎo)的最佳時間點（數(shù)據(jù)未顯示）。與觀察到的表型一致，吉非替尼敏感系NCC-HN19和NCC-HN64（A/A基因型）的Western印跡一致顯示EGFR，AKT，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和核糖體蛋白的磷酸化水平降低，用治療劑量的吉非替尼和厄洛替尼治療后的S6（S6）（圖1b和補(bǔ)充圖1c）。相比之下，具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的細(xì)胞系需要更高的藥物劑量來降低磷酸化AKT和磷酸化S6的水平，并且治療僅對ERK磷酸化水平有一定的影響。

2 單核苷酸編輯逆轉(zhuǎn)了對同基因細(xì)胞系中EGFR TKI的抗性

我們使用腺相關(guān)病毒（AAV）靶向系統(tǒng)通過同源重組產(chǎn)生單核苷酸改變的同基因'敲入'模型（補(bǔ)充圖1d，e）。引入單拷貝的SNP（雜合子）足以將對EGFR TKI（NCC-HN1）的抗性轉(zhuǎn)化為同基因背景上的敏感性（圖1c）。表達(dá)的EGFR cDNA的Sanger測序證實A基因型在成功靶向的克隆中表達(dá)（G/A^AAV：NCC-HN1克隆16（CL16），CL63和CL19），與載體整合的陰性對照相比較（G/G^AAV：NCC-HN1 CL12，CL76和CL77）。 G/A^AAV克隆（CL16，CL19和CL63）的IC₅₀值范圍為0.1-0.3M，而未編輯的G/G^AAV對照（CL12）的值范圍為6.4-7.2M（NCC-HN1親本細(xì)胞系IC₅₀范圍為7-11μM的）（圖1c），用TKI處理后EGFR下游途徑的調(diào)節(jié)一致（圖1d和補(bǔ)充圖1f）?；蛐椭g對EGFR TKI具有相同的差異敏感性模式，但是這種模式在用西妥昔單抗治療后不明顯（圖1e和補(bǔ)充圖1g），針對EGFR的單克隆抗體，目前已在臨床上批準(zhǔn)用于HNSCC治療。該結(jié)果突出了如何在針對EGFR途徑的不同藥物類別中觀察到差異敏感性。

3 長的編碼RNA EGFR-AS1驅(qū)動體外和體內(nèi)EGFR敏感度

數(shù)據(jù)分析顯示沒有可能影響EGFR mRNA轉(zhuǎn)錄或翻譯的潛在microRNA（miRNA）靶向位點（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，我們發(fā)現(xiàn)該SNP位于編碼lncRNA EGFR-AS1的轉(zhuǎn)錄區(qū)域內(nèi)（圖2a）。實時RT-PCR分析顯示EGFR-AS1 lncRNA的水平在具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的EGFR-TKI抗性系中顯著高于具有A/A基因型（NCC-HN19和NCC-HN64）EGFR-TKI敏感系中的水平（圖2b）。類似地，與對照G/G^AAV克隆相比，NCC-HN1的同基因G/A^AAV克隆具有較低的EGFR-AS1 lncRNA水平。使用專門設(shè)計用于檢測EGFR-AS1的NanoString方法進(jìn)一步驗證了這些結(jié)果（補(bǔ)充圖2a）。使用放線菌素D來阻斷轉(zhuǎn)錄，我們接下來證明EGFR-AS1 lncRNA在具有G/G基因型的品系中比在具有A/A基因型的品系中更穩(wěn)定，并且這一發(fā)現(xiàn)在編輯的同基因NCC- HN1克隆中重現(xiàn)（圖2c）。我們接下來檢查了55種頭頸部癌癥的癌癥基因組圖譜（TCGA）RNA-seq數(shù)據(jù)。在這些情況下，發(fā)現(xiàn)EGFR-AS1水平在腫瘤組織中高于在匹配的正常對照中（補(bǔ)充圖2b）。此外，較高水平的lncRNA似乎與G/G基因型相關(guān)，盡管在樣本數(shù)量有限的情況下，這種相關(guān)性沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.1，Wilcoxon秩和檢驗，單尾）。使用兩種不同的小干擾RNA（siRNAs）靶向敲低EGFR-AS1（補(bǔ)充圖2c）足以顯著增加G/G基因型對吉非替尼的細(xì)胞系的敏感性，平均IC₅₀降低NCC-HN1的值為8.9μM至2.6-3.3μM，NCC-HN43的值為9.6μM至0.1-1.2μM，用于兩次獨立的敲低測定（圖2d）。相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡顯示用治療劑量的TKI治療后EGFR下游信號傳導(dǎo)減少（補(bǔ)充圖2d）。相反，野生型EGFR-AS1 lncRNA的異常表達(dá)能夠顯著提高先前敏感的NCC-HN19系中IC₅₀值從0.098μM到0.7-1.4μM，從0.12μM到5.0-5.6μM。CC-HN64分別用于吉非替尼和厄洛替尼，證實了lncRNA在調(diào)節(jié)對TKI耐藥中的作用（圖2e和補(bǔ)充圖2e）。

為了測試EGFR-AS1是否是EGFR敏感度的真正驅(qū)動因素，我們研究了表達(dá)高水平EGFR-AS1的G/A或G/G基因型的腫瘤是否依賴于這種lncRNA，通過使用PDX系統(tǒng)在體內(nèi)進(jìn)行敲低。設(shè)計了一組針對EGFR-AS1的locked nucleic acids（LNA），并且使用通過體外篩選進(jìn)行有效敲低的最有效候選物。隨后將體內(nèi)靶向LNA的EGFR-AS1和對照非靶向LNA注射（每周劑量，5mg/kg體重）到含有PDX的NOD-scid-γ（NSG）小鼠的尾靜脈中。表達(dá)EGFR-Q787Q的腫瘤（HN124）具有G/A基因型和高EGFR-AS1水平。在僅LNA處理1周后，在每天的吉非替尼（25mg/kg體重）上開始小鼠用于實驗的其余部分。與非靶向?qū)φ罩委熛啾龋谟?/span>EGFR-AS1靶向LNA治療后1周，在PDX中觀察到EGFR-AS1水平的成功敲低（補(bǔ)充圖2f）。值得注意的是，與對照相比，在體內(nèi)用LNA靶向EGFR-AS1足以誘導(dǎo)持續(xù)的腫瘤消退（圖2f），其中對照LNA或吉非替尼治療都沒有顯示出任何效果。我們用不同的PDX（HN159：G/G基因型，高EGFR-AS1水平）重復(fù)實驗（圖2f），用EGFR-AS1靶向LNA（成功敲低）再次治療小鼠再次導(dǎo)致腫瘤持續(xù)消退與用對照處理的小鼠相比；這一發(fā)現(xiàn)符合EGFR-AS1 lncRNA介導(dǎo)EGFR敏感度的觀點。

4 通過EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本差異表達(dá)介導(dǎo)EGFR TKI的敏感性

我們繼續(xù)檢查EGFR-AS1 lncRNA對表達(dá)四種已知EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本（A-D）的水平的影響（補(bǔ)充圖3a）。實時PCR分析顯示，EGFR的A和D同基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平存在一致差異，導(dǎo)致A/A基因型（NCC）中同基因轉(zhuǎn)錄本D與同基因轉(zhuǎn)錄本A轉(zhuǎn)錄水平的比例更高。NCC-HN19和NCC-HN64與具有G/G基因型的細(xì)胞系（NCC-HN1和NCC-HN43）相比較；在編輯的G/AAAV克隆中結(jié)果相似（圖3a）。這一發(fā)現(xiàn)可以使用針對EGFR的N末端的抗體在蛋白質(zhì)印跡中重現(xiàn)（補(bǔ)充圖3b）。Northern印跡證實，與A/A基因型和基因型編輯的G/A^AAV克隆相比，具有G/G基因型的品系的同基因轉(zhuǎn)錄本D水平增加（補(bǔ)充圖3c）。此外，使用兩種不同的siRNA靶向敲低EGFR-AS1 lncRNA足以增加同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A的比例，特別是在具有G/G基因型（NCC-HN1和NCC-HN43）的細(xì)胞中，其中主要作用是同基因轉(zhuǎn)錄本D的轉(zhuǎn)錄水平增加，隨之增加對TKI的敏感性（圖3b）。有趣的是，在上述體內(nèi)實驗中，在具有高水平EGFR-AS1表達(dá)（HN124和HN159）的PDX中顯示出增強(qiáng)的治療功效，我們還觀察到EGFR-AS1敲低后收集的腫瘤中同基因轉(zhuǎn)錄本D水平的增加（圖3c）。相反，EGFR-AS1的過表達(dá)導(dǎo)致'低表達(dá)'細(xì)胞系模型NCC-HN19和NCC-HN64的相反作用，其中觀察到同基因轉(zhuǎn)錄本D水平顯著降低和同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比例降低（補(bǔ)充）圖3d）。TCGA中轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量分析類似地顯示在具有最低EGFR-AS1水平的三種腫瘤中同基因轉(zhuǎn)錄本D：異構(gòu)體A比率增加（補(bǔ)充圖3e），盡管TCGA分析存在重大警告，包括該庫中的所有腫瘤都表現(xiàn)出EGFR擴(kuò)增，并且可獲得的RNA-seq數(shù)據(jù)的讀取深度可能不足以確定低豐度轉(zhuǎn)錄本如lncRNA和剪接變體?？傊?，這些數(shù)據(jù)揭示了EGFR-AS1在調(diào)節(jié)EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)中的作用。

考慮到EGFR-AS1對異構(gòu)體D的主要影響，我們研究操縱同基因轉(zhuǎn)錄本D表達(dá)是否會改變對EGFR TKI的敏感性。使用EGFR外顯子15B的獨特序列（補(bǔ)充圖3a）設(shè)計了特異性靶向同基因轉(zhuǎn)錄本D的短發(fā)夾RNA（shRNA）。NCC-HN19，NCC-HN64，NCC-HN1和NCC-HN43細(xì)胞系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染導(dǎo)致靶向同基因轉(zhuǎn)錄本D而非同基因轉(zhuǎn)錄本A的特異性（補(bǔ)充圖3f）。先前對吉非替尼敏感的模型，NCC-HN19和NCC-HN64（均具有A/A基因型）在同基因轉(zhuǎn)錄本D敲低后呈現(xiàn)更強(qiáng)的抗性（圖3d），并且對于具有這些模型的細(xì)胞沒有顯著影響。類似地，編輯的G/A^AAV克隆中的靶向同基因轉(zhuǎn)錄本D導(dǎo)致TKI敏感性降低，而對陰性對照沒有影響。相對于非靶向?qū)φ眨?/span>同基因轉(zhuǎn)錄本D的表達(dá)降低也減弱了吉非替尼和厄洛替尼對具有A/A基因型的細(xì)胞系中下游EGFR途徑活性的影響（圖3e和補(bǔ)充圖3g）。值得注意的是，EGFR-AS1敲低對促進(jìn)吉非替尼敏感性的作用在具有G/G基因型的細(xì)胞同時敲低EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D被消除（圖3f）。為了確定對EGFR TKIs的敏感性是否是配體依賴性，將細(xì)胞系在含有血清，無血清培養(yǎng)基，補(bǔ)充有表皮生長因子（EGF）的無血清培養(yǎng)基和含有西妥昔單抗或尼妥珠單抗的無血清培養(yǎng)基的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)。阻斷配體結(jié)合。然后用吉非替尼和異丙腎上腺素處理細(xì)胞。與無血清條件相比，具有A/A基因型和基因型轉(zhuǎn)換的G/A^AAV克隆的細(xì)胞中兩種藥物的IC₅₀值在富含血清和EGF的培養(yǎng)基中顯著降低（圖3g和補(bǔ)充圖3h）。值得注意的是，在無血清和EGF富集條件下，EGFR阻斷（臨床中使用兩種不同的抗EGFR單克隆抗體）能夠提高吉非替尼的IC₅₀水平，證實對EGFR TKI敏感性的調(diào)節(jié)確實是配體依賴性的，但也暗示了自分泌和/或旁分泌效應(yīng)。

總之，我們已經(jīng)闡明了EGFR敏感度的一種新的非經(jīng)典機(jī)制，其中EGFR-AS1 lncRNA的表達(dá)增加導(dǎo)致EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本A和D的差異剪接以及隨后的EGFR途徑的配體依賴性激活。

5 EGFR-AS1 lncRNA和EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比率代表對EGFR TKI的響應(yīng)的新生物標(biāo)志物

我們擴(kuò)展了我們的機(jī)制研究結(jié)果，以確定我們收集的8種患者來源的細(xì)胞系中的生物標(biāo)志物，這些細(xì)胞系用一系列EGFR抑制劑治療。為了篩選這些生物標(biāo)志物，我們開發(fā)了一種RT-PCR檢測方法，用于確定轉(zhuǎn)錄水平以及患者來源的細(xì)胞系和臨床樣本中EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本A和D的相對水平，以及基于組織的檢測使用RNA原位雜交（RNAscope）。首先，我們發(fā)現(xiàn)EGFR-AS1水平與患者來源細(xì)胞系中IC₅₀水平呈正相關(guān)；最強(qiáng)的相關(guān)性是吉非替尼（r2 = 0.86; P = 0.001）和厄洛替尼（r2 = 0.84; P = 0.0039）（基于Pearson相關(guān)系數(shù)），并且A/A和G/G基因型之間存在明顯的差異（圖4a）。接下來，我們使用RT-PCR對細(xì)胞系中的EGFR-AS1水平與EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本A和D的相對水平相關(guān)聯(lián)，并且我們還使用RNAscope檢查了EGFR-AS1水平與組織中原位RNA表達(dá)的關(guān)系（半定量分級為1+或0）（圖4b和補(bǔ)充圖4a）?？赡艿那闆r下，使用專門設(shè)計用于檢測EGFR-AS1 lncRNA的NanoString實驗確認(rèn)EGFR-AS1水平（補(bǔ)充圖4b）。在具有A/A基因型的細(xì)胞中，EGFR-AS1沒有檢測到，同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比率增加。相反，在具有G/A或G/G基因型的細(xì)胞中，EGFR-AS1水平高，具有低同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比率（圖4c）?；仡櫡治鰞擅厥?/span>響應(yīng)者（患者P8526（OSCC）和患者P4205（口咽SCC））用吉非替尼治療，接著吉非替尼聯(lián)合放療，顯示其具有EGFR-Q787Q的A/A基因型，并且檢測不到或低EGFR-AS1水平（通過RNAscope和NanoString分別）與對照組相比，對相同的治療方案沒有反應(yīng)（患者P8241和患者P3911，均為OSCC）（圖4c和補(bǔ)充圖4b-d）。通過新加坡臨床試驗（IMPACT-SG）計劃（NCT02806388；在補(bǔ)充表2中總結(jié)的所有患者細(xì)節(jié)）前瞻性地分析了另外7名患者，并且發(fā)現(xiàn)其具有A/A基因型；在所有具有足夠組織進(jìn)行分析的患者中，RNAscope和/或?qū)崟rRT-PCR/NanoString分析顯示EGFR-AS1分別檢測不到或低水平。所有這些患者都表現(xiàn)出對EGFR TKI治療的臨床，放射學(xué)和/或生化反應(yīng)（圖4c和補(bǔ)充圖4e-j）。

對于該組中的三名患者，衍生出離體模型（來自患者來源的細(xì)胞培養(yǎng)物或異種移植物）并用于進(jìn)一步研究A/A基因型EGFR-Q787Q，EGFR-AS1水平和EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比率在對TKI反應(yīng)的生物標(biāo)志物。我們驗證了EGFR-Q787Q A/A基因型的存在，并在所有三名患者中通過實時PCR確認(rèn)了低水平的EGFR-AS1和高EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比例（圖4c）。模型推導(dǎo)如下：HN137-PDX源自原發(fā)性腫瘤組織和轉(zhuǎn)移灶，HN177-PDX源自轉(zhuǎn)移灶，HN148-原代細(xì)胞培養(yǎng)物源自原發(fā)性腫瘤組織。對于HN137和HN177，擴(kuò)增PDX并分別用吉非替尼和厄洛替尼治療小鼠。與未治療的對照相比，當(dāng)用EGFR TKI治療時，兩種PDX腫瘤均顯示出顯著的腫瘤消退（圖4d，e）。根據(jù)這些結(jié)果，HN137和HN177來源的患者分別開始每日250mg劑量的吉非替尼和150mg劑量的厄洛替尼治療。放射學(xué)評估顯示治療6周后轉(zhuǎn)移性病變和血清腫瘤標(biāo)志物（H1917的CA19-9）消退（圖4d，e），3個月后持續(xù)應(yīng)答（補(bǔ)充圖4i）。對于HN148，源自患者的培養(yǎng)物在體外對EGFR TKI表現(xiàn)出很好的反應(yīng)（圖4a）。因此，當(dāng)患者出現(xiàn)無法切除的局部復(fù)發(fā)時，他接受吉非替尼單藥治療，并在治療2個月后表現(xiàn)出顯著的腫瘤縮?。ㄑa(bǔ)充圖4j）。

總之，我們的臨床和患者衍生模型突出了不同生物標(biāo)志物維度之間復(fù)雜的相互作用，并提供了我們所知的生物標(biāo)志物的第一個例子之一 -包括同義基因組改變，lncRNA的表達(dá)水平和可變剪接的EGFR變體。有助于準(zhǔn)確預(yù)測EGFR TKI的臨床反應(yīng)。

4 討論

盡管美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)了針對HNSCC的EGFR靶向療法，但尚未建立針對這些癌癥的強(qiáng)有力的預(yù)測性標(biāo)志物。在這里，我們報道了由lncRNA EGFR-AS1介導(dǎo)的EGFR敏感度的新機(jī)制，并顯示了同義單核苷酸變體如何通過調(diào)節(jié)lncRNA穩(wěn)定性以及因此相關(guān)的lncRNA的表達(dá)水平對藥物敏感性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。隨后EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D：同基因轉(zhuǎn)錄本A比率的增加導(dǎo)致配體驅(qū)動的EGFR途徑激活。這些機(jī)制研究的結(jié)果得到SCC患者（6例OSCC，1例鼻腔，1例食管和1例肺癌）（n = 9）結(jié)果的支持，所有患者均表現(xiàn)出對EGFR TKI的臨床相關(guān)抗腫瘤反應(yīng)EGFR-Q787Q的A/A基因型，EGFR-AS1水平低或檢測不到。癌癥中最具預(yù)測性的標(biāo)志物是基于基因組學(xué)的，并且主要局限于改變mRNA和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的非同義突變。據(jù)我們所知這是第一次報道，描述了非同義突變的SNP如何降低lncRNA的水平并調(diào)節(jié)對EGFR抑制劑的敏感性。本研究，定義了一個全面的生物標(biāo)志物套裝，最終需要在更大的患者群體中進(jìn)一步驗證，以精確預(yù)測哪些患者可能對EGFR TKIs有反應(yīng)，從而最終導(dǎo)致EGFR激活。

lncRNAs的轉(zhuǎn)錄本范圍為200 nt至100 kb，分布于整個基因組中。雖然它們具有很少或沒有蛋白質(zhì)編碼能力，但它們具有多種功能，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，通過染色體修飾的表觀遺傳調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。這些功能中的一些涉及與DNA，前mRNA和成熟mRNA的直接（基于同源性）結(jié)合。據(jù)報道，lncRNA的三維結(jié)構(gòu)構(gòu)象在決定這些分子的穩(wěn)定性和擴(kuò)展其廣泛的功能方面起著重要作用。 EGFR-AS1是2.8kb的轉(zhuǎn)錄物，對應(yīng)于EGFR基因的內(nèi)含子和外顯子20（圖2a）。我們的數(shù)據(jù)指出SNP在外顯子20中的關(guān)鍵作用導(dǎo)致EGFR-AS1內(nèi)的單核苷酸變體影響該lncRNA的穩(wěn)定性-可能是由于高級結(jié)構(gòu)的變化。沿著編碼EGFR-AS1的區(qū)域的其他同義和非同義突變可以調(diào)節(jié)EGFR敏感度也是合理的。盡管EGFR-AS1水平影響EGFR轉(zhuǎn)錄本的可變剪接的機(jī)制仍然知之甚少，但我們假設(shè)直接順式介導(dǎo)的效應(yīng)導(dǎo)致同基因轉(zhuǎn)錄本D：異構(gòu)體A比例增加。EGFR-AS1轉(zhuǎn)錄本在細(xì)胞核中的定位，其中該lncRNA可以影響轉(zhuǎn)錄和/或前mRNA加工，這支持了這一假設(shè)（通過RNA原位雜交觀察到；圖4b）。進(jìn)一步的證據(jù)來自于20世紀(jì)90年代早期發(fā)表的一項有趣的研究，其中一種來自EGFR基因的天然反義RNA被描述為調(diào)節(jié)EGFR基因剪接。未來的研究應(yīng)著眼于提高對轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)，表達(dá)調(diào)控或剪接變體（如果存在）的功能意義的理解。值得注意的是，操縱基因型從A/A到G/A，或更直接地降低EGFR-AS1 lncRNA的水平（體外和體內(nèi)），足以以一致和可預(yù)測的方式增加對EGFR TKI的敏感性，這通過敲低EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本D可以消除這種作用，這可能是該表型的效應(yīng)物。

迄今為止，天然存在的EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本的作用研究很少，一些研究表明，替代同基因轉(zhuǎn)錄本在血漿中分泌（作為分泌的EGFR或sEGFR），并且可能與肺癌和宮頸癌中預(yù)后有關(guān)。之前的一項研究表明，同基因轉(zhuǎn)錄本D水平的增加（如此處所示）導(dǎo)致對吉非替尼的敏感性增加，盡管該研究基于單個子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系。此外，對使用erlo-tinib治療的非小細(xì)胞肺癌患者的sEGFR水平進(jìn)行分析支持了這樣的觀點，即更高水平的sEGFR可預(yù)測對TKI的敏感性，盡管研究者沒有區(qū)分測量的特定同基因轉(zhuǎn)錄本。正如我們的研究所證明的，缺乏酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的同基因轉(zhuǎn)錄本D相對于全長同工酶A的相對增加，以及需要配體驅(qū)動的EGFR激活，提示了涉及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的機(jī)制。雖然缺乏針對每種EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本的特異性抗體對空間定位和定量施加限制，但mRNA轉(zhuǎn)錄本的分析可能是一種可行的替代方法，如此處使用實時RT-PCR或RNAscope所示。

從我們的數(shù)據(jù)中得出了幾個值得注意的含義。我們已經(jīng)證明lncRNA EGFR-AS1是EGFR敏感度的真正驅(qū)動因素，并且代表SCC子集中的新治療靶標(biāo)，其可能通過已經(jīng)進(jìn)入臨床測試的基于RNA干擾（RNAi）的策略靶向。同義改變影響EGFR敏感度的能力為發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有靶向治療的先前未知的生物標(biāo)志物開辟了新的途徑，具有相當(dāng)大的潛在的臨床影響。值得注意的是，這種SNP（純合A/A基因型）的流行率在亞洲人群中為4％（如本文所述），但在歐洲血統(tǒng)人群中有30％（見URL），這增加了臨床適用性地理差異的可能性。 EGFR-AS1基因上可能存在其他單核苷酸變異，這些變異也可能影響lncRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和/或功能，但傳統(tǒng)的EGFR或外顯子組測序分析未檢測到這些變異。正在進(jìn)行的和未來的前瞻性臨床研究需要擴(kuò)展我們的研究結(jié)果中描述的特征驗證，作為對EGFR TKI反應(yīng)的可靠生物標(biāo)志物，并進(jìn)一步闡明lncRNA表達(dá)和EGFR途徑激活的其他決定因素，如組織學(xué)和/或表觀遺傳學(xué)背景?？傊覀円呀?jīng)描繪了激活EGFR途徑的替代生物標(biāo)志物路線圖 - 從基因型開始并導(dǎo)致EGFR-AS1 lncRNA水平的改變，相對EGFR同基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)和配體表達(dá) - 強(qiáng)調(diào)了建立多維分層生物標(biāo)志物套件的需要。

（注：本研究未說明是如何發(fā)現(xiàn)這個SNP位點，也沒有交代lncRNA，及EGFR同基因不同轉(zhuǎn)錄本D與A表達(dá)比率參與影響發(fā)現(xiàn)過程，小編以為通過找到典型病人后，外顯子測序，RNAseq差不多可以發(fā)現(xiàn)，但仍要具有考慮這方面的意識才好。）