lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling

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lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling

lncRNA MIR100HG衍生的miR-100和miR-125b通過Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)西妥昔單抗耐藥

雜志：Nature medicine； 影響因子：32.621

發(fā)表單位：范德比爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)中心

導(dǎo)讀

腫瘤耐藥是一個(gè)普遍現(xiàn)象，西妥昔單抗是針對(duì)表皮生長因子受體EGFR常見靶向藥，但常出現(xiàn)耐藥性，本研究對(duì)耐藥和不耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行外顯子測(cè)序，RNA-Seq。未發(fā)現(xiàn)重要的位點(diǎn)突變，RNA-Seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)lncRNA MIR100HG，miRNA miR-125b和miR-100差異最為明顯，后兩個(gè)miRNA是前者lncRNA基因座上轉(zhuǎn)錄出來的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MIR100HG，miR-125b和miR-100的高表達(dá)提高了癌細(xì)胞耐藥性。富集分析發(fā)現(xiàn)Wnt通路顯著激活，miR-125b和miR-100可以抑制Wnt通路五種負(fù)調(diào)節(jié)因子表達(dá)。通過分析調(diào)節(jié)MIR100HG表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)GATA6可以抑制MIR100HG的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)miR-125b可以抑制GATA6的表達(dá)，GATA6，MIR100HG和miR-125b之間形成雙負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路調(diào)節(jié)耐藥。

1 摘要

原發(fā)性和獲得性耐藥主要原因是遺傳改變，是抗表皮生長因子受體（EGFR）高效治療的障礙。為了獲得西妥昔單抗耐藥細(xì)胞，我們?cè)谌S培養(yǎng)中將西妥昔單抗敏感的結(jié)直腸癌細(xì)胞用西妥昔單抗處理。使用全外顯子組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA MIR100HG和兩個(gè)衍生的microRNA，miR-100和miR-125b高表達(dá)。在西妥昔單抗耐藥結(jié)直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系以及西妥昔單抗耐藥結(jié)直腸癌患者的腫瘤中也觀察到MIR100HG，miR-100和miR-125b高表達(dá)。miR-100和miR-125b協(xié)同抑制5個(gè)Wnt /β-catenin負(fù)調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路激活，并且西妥昔單抗耐藥細(xì)胞中的Wnt抑制，恢復(fù)了西妥昔單抗藥效。我們的結(jié)果描述了MIR100HG和轉(zhuǎn)錄因子GATA6之間的雙負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其中GATA6抑制MIR100HG，但是這種抑制通過miR-125b靶向GATA6而減輕。這些發(fā)現(xiàn)確定了西妥昔單抗耐藥的臨床潛在的表觀遺傳原因。

2 研究背景

結(jié)直腸癌（CRC）仍然是全球癌癥死亡的主要原因。西妥昔單抗和帕尼單抗是EGFR單克隆抗體（mAb），其結(jié)合EGFR的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并增強(qiáng)受體內(nèi)化和降解。這些EGFR mAb是野生型KRAS轉(zhuǎn)移性CRC患者的常見靶向藥物。當(dāng)作為單一療法治療時(shí)，EGFR mAb在12-17％的患者中產(chǎn)生持久反應(yīng)，并且當(dāng)mAb與化學(xué)療法組合時(shí)高達(dá)72％的反應(yīng)率。然而，經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性。大量努力已經(jīng)確定了許多原發(fā)性和獲得性EGFR mAb治療耐藥遺傳機(jī)制，包括KRAS，NRAS，BRAF，PIK3CA和EGFR突變。然而，關(guān)于非遺傳耐藥機(jī)制知之甚少。

非編碼RNA（ncRNA），特別是長非編碼RNA（lncRNA）和microRNA（miRNA），對(duì)表觀遺傳調(diào)控至關(guān)重要。最近，已發(fā)現(xiàn)這兩類調(diào)節(jié)性ncRNA之間的復(fù)雜相互作用，其中一些lncRNA被加工以產(chǎn)生抑制靶mRNA的miRNA。例如，lncRNA-H19衍生的miR-675抑制胰島素生長因子受體的翻譯，抑制細(xì)胞應(yīng)激時(shí)細(xì)胞增殖或致癌信號(hào)。由lncRNA MIR17HG基因座產(chǎn)生的miR-17~92減弱TGF-β信號(hào)通路，刺激血管生成和腫瘤生長。lncRNA MIR100HG衍生的miRNA miR-100，let-7a-2和miR-125b-1簇以及MIR99AHG衍生的miRNA miR-99a，let-7c和miR-125b-2簇參與急性巨核細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)制。然而，這些lncRNA或衍生的miRNA是否參與耐藥性在很大程度上是未知的。

我們確定了lncRNA MIR100HG和兩種衍生的miRNA（miR-100和miR-125b）在西妥昔單抗耐藥中的作用。我們發(fā)現(xiàn)MIR100HG，miR-100和miR-125b在原發(fā)性和在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）細(xì)胞系中獲得西妥昔單抗耐藥的過程中高表達(dá)。miR-100和miR-125b協(xié)調(diào)下調(diào)經(jīng)典Wnt /β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)（以下稱為Wnt信號(hào)傳導(dǎo)）的5種負(fù)調(diào)節(jié)因子（DKK1，DKK3，ZNRF3，RNF43和APC2），導(dǎo)致Wnt信號(hào)傳導(dǎo)增加。體外和體內(nèi)Wnt抑制恢復(fù)了對(duì)西妥昔單抗的響應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)這些事件發(fā)生在腫瘤在西妥昔單抗耐藥的CRC患者中。我們還發(fā)現(xiàn)MIR100HG過表達(dá)通過miR-125b抑制GATA6得到加強(qiáng)，GATA6在穩(wěn)態(tài)下抑制MIR100HG。我們的研究結(jié)果確定了西妥昔單抗耐藥的表觀遺傳原因，具有診斷和治療意義。

3 結(jié)果

1 在三維培養(yǎng)中建立西妥昔單抗耐藥細(xì)胞

我們將來自人KRAS/NRAS/BRAF野生型，微衛(wèi)星不穩(wěn)定的CRC細(xì)胞系HCA-7的單細(xì)胞置于1型膠原的三維（3D）培養(yǎng)物中，從具有囊性形態(tài)的菌落中獲得細(xì)胞系，我們指定囊性菌落（CC）。西妥昔單抗在3D培養(yǎng)中抑制CC的增殖，但在二維（2D）培養(yǎng)中則不然。在3D培養(yǎng)中連續(xù)暴露于西妥昔單抗約4個(gè)月后，我們產(chǎn)生了西妥昔單抗耐藥CC（CC-CR；圖1a）。在2D培養(yǎng)中，CC和CC-CR在形態(tài)上無法區(qū)分。然而，在3D培養(yǎng)中，CC形成中空囊腫，其中心腔由單層極化細(xì)胞排列，而CC-CR形成固體無序菌落（圖1b）。正如預(yù)期的那樣，西妥昔單抗抑制3D培養(yǎng)中CC生長，而CC-CR仍然是西妥昔單抗耐藥的直到200μg/ml（圖1c和補(bǔ)充圖1a，b）。在西妥昔單抗治療后24小時(shí)，我們觀察到增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)減少和凋亡標(biāo)志物Caspase-3表達(dá)增加，但這些指數(shù)在CC-CR中未受影響（圖1d）。在西妥昔單抗中-在治療CC后，我們觀察到p-EGFR，p-ERK1/2，p-AKT和細(xì)胞周期蛋白D1水平降低，以及裂解的Caspase-3和促凋亡標(biāo)志物BIM增加；這些標(biāo)志物在西妥昔單抗治療的CC-CR中基本上沒有受到影響（圖1e）。接下來，我們用表達(dá)GFP的慢病毒載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染CC和CC-CR，然后將細(xì)胞系皮下注射到無胸腺裸鼠中。CC腫瘤在西妥昔單抗給藥后得到很好的分化和消退。CC-CR腫瘤分化差，并且在西妥昔單抗存在下繼續(xù)生長，盡管未達(dá)到未治療腫瘤的程度（圖1f，g和補(bǔ)充圖1c-e）。

2 上調(diào)西妥昔單抗耐藥細(xì)胞中MIR100HG和衍生的miR-100和miR-125b的上調(diào)

我們首先考慮了該3D模型中已知的西妥昔單抗耐藥機(jī)制。使用全外顯子組測(cè)序和RNA測(cè)序（RNA-Seq），我們未發(fā)現(xiàn)與西妥昔單抗耐藥相關(guān)的已知遺傳事件，包括所有報(bào)道的基因突變，拷貝數(shù)變化和基因融合事件（補(bǔ)充表1）。使用RNA-Seq，我們發(fā)現(xiàn)141個(gè)轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，220個(gè)轉(zhuǎn)錄本在CC-CR中與CC相比下調(diào)（倍數(shù)變化> 2且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01）。ERBB1-4，七種EGFR配體和MET的表達(dá)水平在CC和CC-CR之間是相當(dāng)?shù)模ㄑa(bǔ)充表2）。免疫熒光還顯示CC和CC-CR中的等效細(xì)胞表面EGFR染色（補(bǔ)充圖1f）。小RNA-Seq檢測(cè)到7個(gè)上調(diào)的miRNA和24個(gè)在CC-CR中與CC相比下調(diào)的miRNA（倍數(shù)變化> 2且FDR <0.01）。值得注意的是，CC-CR中最上調(diào)的轉(zhuǎn)錄物是lncRNA MIR100HG，并且兩種最上調(diào)的miRNA是miR-125b和miR-100（圖2a）。

MIR100HG是11號(hào)染色體上miR-100，let-7a-2和miR-125b-1簇的宿主基因（圖2b）。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qRT-PCR）分析證實(shí)了在西妥昔單抗存在或不存在下CC-CR中內(nèi)源性MIR100HG表達(dá)的上調(diào)（圖2c）。pri-miR-100，pri-miR-125b-1及其相應(yīng)的成熟miRNA，miR-100和miR-125b也富含在CC-CR（圖2c和補(bǔ)充圖2a）。盡管pri-let-7a-2在CC-CR中上調(diào)，但成熟let-7a表達(dá)與CC相比沒有變化（補(bǔ)充圖2b）。通過5'RACE-PCR（補(bǔ)充圖2c）證實(shí)MIR100HG的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）。癌癥基因組圖譜（TCGA）CRC數(shù)據(jù)庫的分析顯示miR-100和miR-125b表達(dá)與MIR100HG表達(dá)緊密相關(guān)（圖2d）。RNA熒光原位雜交（FISH）顯示在CC-CR腫瘤異種移植物中高度富集的MIR100HG，miR-100和miR-125b表達(dá)（圖2e）。相反，let-7a表達(dá)與MIR100HG的表達(dá)無關(guān)（補(bǔ)充圖2d）。

為了評(píng)估MIR100HG，miR-100和miR-125b是否不只在這一個(gè)細(xì)胞系高表達(dá)，我們根據(jù)已發(fā)表的數(shù)據(jù)檢查了它們?cè)?0個(gè)CRC細(xì)胞系中的表達(dá)，這些細(xì)胞系基于西妥昔單抗敏感性和耐藥性（補(bǔ)充表3）。與更敏感的細(xì)胞系相比，MIR100HG，miR-100和miR-125b在西妥昔單抗耐藥細(xì)胞系表達(dá)更多（圖2f）。無論KRAS/BRAF突變狀態(tài)如何，它們的表達(dá)與西妥昔單抗耐藥呈負(fù)相關(guān)（補(bǔ)充圖2e，f）。例如，西妥昔單抗敏感的兩個(gè)細(xì)胞（GEO和SW403）表達(dá)低水平的MIR100HG，miR-100和miR-125b，盡管含有突變體KRAS。此外，我們還觀察到在HNSCC細(xì)胞系中西妥昔單抗耐藥中MIR100HG，miR-100和miR-125b的上調(diào)（補(bǔ)充圖3a）。因此，MIR100HG，miR-100和miR-125b在CRC和HNSCC細(xì)胞系中的西妥昔單抗耐藥中上調(diào)，并且這種現(xiàn)象發(fā)生在獲得性和新生耐藥中。這些發(fā)現(xiàn)使我們進(jìn)一步探索MIR100HG，miR-100和miR-125b在西妥昔單抗耐藥中的功能。

3 miR-100和miR-125b協(xié)同作用驅(qū)動(dòng)西妥昔單抗耐藥

鑒于某些lncRNA的主要作用是產(chǎn)生miRNA，我們研究西妥昔單抗耐藥是否由miR-100和miR-125b過表達(dá)介導(dǎo)。為此，我們分別將基于慢病毒過表達(dá)和海綿構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)入CC和CC-CR，以產(chǎn)生表達(dá)miRNA的穩(wěn)定細(xì)胞系，miR-100/ miR-125b雙順反子或其相應(yīng)的海綿（補(bǔ)充圖3b， C）。雖然miR-100海綿對(duì)3D培養(yǎng)中CC-CR的菌落數(shù)沒有顯著影響，但miR-125b和雙順反子海綿都顯著減少了菌落數(shù)（圖3a）。在西妥昔單抗存在下，miR-100海綿適度減少了菌落數(shù)，而miR-125b海綿和雙順反子海綿的菌落數(shù)減少更明顯（圖3a）。在miR-100和miR-125b過表達(dá)后，CC中觀察到相反的效應(yīng)，無論是單獨(dú)還是一起。 miR-100/miR-125b雙順反子，但不是單個(gè)miRNA，增加了CC中的菌落數(shù)（圖3b）。西妥昔單抗治療后，miR-100/miR-125b雙順反子具有最強(qiáng)的促存活效果；當(dāng)單獨(dú)引入時(shí)，miR-125b比miR-100具有更大的作用（圖3b）。在CC-CR中的不同海綿和CC中的不同miRNA表達(dá)后，在形態(tài)學(xué)變化以及Ki-67和裂解的Caspase-3染色中觀察到類似的相反效應(yīng)（圖3c，d和補(bǔ)充圖3D，E）。此外，miR-100/miR-125b雙順反子在Caco-2細(xì)胞中過表達(dá)（低內(nèi)源性miR-100/miR-125b表達(dá)）使細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的反應(yīng)性降低，而miR-100/miR-125b的抑制作用降低。DLD-1細(xì)胞中的125b雙順反子和來自HNSCC SCC25的CTX-R7細(xì)胞（均具有高內(nèi)源性miR-100/miR-125b表達(dá)）恢復(fù)了西妥昔單抗反應(yīng)性（補(bǔ)充圖4）。當(dāng)具有不同操作的CC-CR和CC細(xì)胞在裸鼠中建立為皮下異種移植物并用西妥昔單抗治療時(shí)觀察到類似的結(jié)果（圖3e，f和補(bǔ)充圖5）?？傊@些結(jié)果與miR-100和miR-125b協(xié)同賦予西妥昔單抗耐藥的模型一致。

4 miR-100和miR-125b抑制多個(gè)Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子并增加Wnt信號(hào)傳導(dǎo)

為了理解miR-100和miR-125b如何影響西妥昔單抗的反應(yīng)，我們認(rèn)為CC-CR中最下調(diào)的基因是這些miRNA的潛在靶標(biāo)。與CC相比，CC-CR中Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的兩個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子DKK1和DKK3的表達(dá)降低了30倍以上（圖2a）。通過分析64個(gè)共有β-catenin靶基因（補(bǔ)充圖6a）確定，CC-CR中Wnt活性增強(qiáng)。對(duì)大型人類CRC數(shù)據(jù)集（n = 458例）的分析也顯示MIR100HG表達(dá)水平與Wnt評(píng)分呈正相關(guān)，而在MIR100HG與Ras-Az評(píng)分之間未觀察到相關(guān)性，MEK活化引起下游RAS信號(hào)產(chǎn)生（補(bǔ)充圖6a和數(shù)據(jù)未示出）。功能富集分析進(jìn)一步鑒定了miR-100和miR-125b靶標(biāo)中的Wnt途徑富集（補(bǔ)充表4）。因此，我們考慮了miR-100和miR-125b是否可能靶向Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的組分。使用靶基因預(yù)測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)DKK1和DKK3的3個(gè)非翻譯區(qū)（UTR）分別含有miR-100和miR-125b的結(jié)合位點(diǎn)（圖4a）。鑒于聚集的miRNA共表達(dá)并且通常通過靶向相同途徑的不同組分來協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)分子途徑，我們搜索了包含miR-100或miR-125b的推測(cè)結(jié)合位點(diǎn)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的其他負(fù)調(diào)節(jié)因子，并鑒定了ZNRF3，RNF43和APC2作為單獨(dú)或組合的miR-100或miR-125b的潛在靶標(biāo)（圖4a和補(bǔ)充表5）。通過細(xì)胞系中的免疫印跡和異種移植物中的免疫染色證實(shí)CC-CR中這五種Wnt陰性調(diào)節(jié)劑與CC相比的蛋白質(zhì)水平降低（補(bǔ)充圖6b，c）。使用3'UTR熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定，我們證實(shí)這五種候選物是CC和Caco-2細(xì)胞中miR-100和/或miR-125b的直接靶標(biāo)。通過相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)的突變挽救了這些基因的抑制（圖4b，c和補(bǔ)充圖6d）。免疫印跡證實(shí)miR-100和miR-125b單獨(dú)或在CC和CC-CR中組合對(duì)預(yù)測(cè)靶標(biāo)的調(diào)節(jié)（圖4d）。一致地，在Caco-2細(xì)胞（低內(nèi)源性miR-100/miR-125b表達(dá)）和HuTu80細(xì)胞（高內(nèi)源性miR-100/miR-125b表達(dá)）中也觀察到該調(diào)節(jié)（補(bǔ)充圖6e）。

我們接下來檢查了miR-100-和miR-125b誘導(dǎo)的這些Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子的下調(diào)是否導(dǎo)致Wnt信號(hào)傳導(dǎo)增加。盡管總β-catenin水平?jīng)]有顯著改變，但與3D培養(yǎng)中的CC相比，CC-CR顯示出活性酪氨酸磷酸化的p-Y489 β-catenin和增加的核β-catenin增加（圖4e和補(bǔ)充圖6f）。一致地，β-catenin主要局限于CC異種移植物中的質(zhì)膜，而其在CC-CR異種移植物中主要是核（圖4f）。此外，一組Wnt靶基因的mRNA表達(dá)在CC-CR與CC中顯著富集（圖4g）。西妥昔單抗阻斷了CC中Wnt3a誘導(dǎo)的Wnt激活，但對(duì)CC-CR中Wnt3a誘導(dǎo)的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)沒有明顯影響（補(bǔ)充圖6g）。西妥昔單抗治療也導(dǎo)致CC中Wnt靶基因在48小時(shí)內(nèi)顯著且持續(xù)減少，而CC-CR中這些基因的表達(dá)在治療后的早期時(shí)間點(diǎn)僅略微下降，并在稍后的時(shí)間點(diǎn)反彈（補(bǔ)充圖 6H）。此外，在穩(wěn)定過表達(dá)miR-100或miR-125b的CC和Caco-2細(xì)胞中核β-catenin水平增加，并且在表達(dá)miR-100/miR-125b雙順反子的細(xì)胞中增加更多（補(bǔ)充圖7a）。相反，在CC-CR，DLD-1和CTX-R7細(xì)胞中過表達(dá)miR-100/miR-125b雙順反子海綿后，核β-catenin水平降低（補(bǔ)充圖7a）。還觀察到Wnt靶基因的相應(yīng)變化（圖4h和補(bǔ)充圖4e）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，核β-catenin免疫反應(yīng)性在表達(dá)miR-100/miR-125b雙順反子的CC裸鼠異種移植物中增加，并且在表達(dá)雙順反子海綿的CC-CR對(duì)應(yīng)物中減少（補(bǔ)充圖7b）。

基于我們?cè)贑C-CR中增加Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)通過抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可以恢復(fù)西妥昔單抗反應(yīng)性。鑒于DKK1和DKK3是分泌的Wnt拮抗劑并且是CC-CR中最下調(diào)的基因之一，我們測(cè)試了它們的過表達(dá)是否可以使用強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的慢病毒系統(tǒng)來克服西妥昔單抗耐藥。雖然DKK1或DKK3的誘導(dǎo)導(dǎo)致菌落數(shù)略微減少，但通過添加西妥昔單抗增強(qiáng)了這種效果（補(bǔ)充圖8a，b）。此外，重組DKK1和DKK3的施用增強(qiáng)了西妥昔單抗降低增殖和增加細(xì)胞凋亡的能力（補(bǔ)充圖8c）。此外，當(dāng)在西妥昔單抗存在下在CC-CR中誘導(dǎo)表達(dá)DKK1或DKK3時(shí)，核β-catenin表達(dá)降低（補(bǔ)充圖8d）。我們接下來測(cè)試了使用端錨聚合酶抑制劑XAV-939和β-catenin/ CBP抑制劑ICG-001對(duì)Wnt活性的藥理學(xué)抑制是否使CC-CR對(duì)西妥昔單抗敏感。兩種化合物均引起菌落數(shù)的濃度依賴性降低，并且通過添加增強(qiáng)西妥昔單抗生長抑制（補(bǔ)充圖8e）。ICG-001還增強(qiáng)了西妥昔單抗在具有高表達(dá)MIR100HG的其他CRC和HNSCC細(xì)胞系中的生長抑制作用（補(bǔ)充圖4e和8f）。在CC-CR裸鼠異種移植物中，單獨(dú)給予西妥昔單抗和ICG-001僅減緩腫瘤生長；然而，聯(lián)合治療導(dǎo)致腫瘤消退（圖4i-k和補(bǔ)充圖8g，h）。因此，在APC/β-catenin降解復(fù)合物的上游或下游阻斷Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，恢復(fù)西妥昔單抗對(duì)西妥昔單抗耐藥細(xì)胞的反應(yīng)性。

5 GATA6和MIR100HG/miR-125b之間的相互負(fù)調(diào)節(jié)

為了探索miR-100和miR-125b在CC-CR中上調(diào)的機(jī)制，我們研究了宿主基因MIR100HG的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。使用Match程序（版本1.0）在計(jì)算機(jī)中繪制含有MIR100HG的2.5kb啟動(dòng)子中的結(jié)合位點(diǎn)的可能轉(zhuǎn)錄因子，并與RNA-Seq數(shù)據(jù)集取交集（補(bǔ)充表6）。在這些轉(zhuǎn)錄因子中，我們關(guān)注的是鋅指轉(zhuǎn)錄因子GATA6，其在3D培養(yǎng)和裸鼠異種移植物中在CC-CR的mRNA和蛋白水平均下調(diào)（圖2a和5a-c）。

GATA6對(duì)于腸道內(nèi)胚層發(fā)育至關(guān)重要，它可以促進(jìn)和抑制胃腸道和胰腺腫瘤。我們發(fā)現(xiàn)在西妥昔單抗處理的CC中MIR100HG表達(dá)降低，而GATA6 mRNA在48小時(shí)內(nèi)逐漸增加（圖5d）；然而，這種現(xiàn)象在CC-CR中沒有發(fā)生（數(shù)據(jù)未顯示）。CC中的GATA6敲低（圖5e，上圖和補(bǔ)充圖9a）導(dǎo)致MIR100HG上調(diào)，并且在西妥昔單抗治療后其表達(dá)不再降低（圖5e，下圖），表明GATA6對(duì)MIR100HG的抑制作用。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定顯示，GATA6的過表達(dá)（補(bǔ)充圖9b）導(dǎo)致MIR100HG啟動(dòng)子活性的濃度依賴性抑制（圖5f）。在MIR100HG啟動(dòng)子區(qū)域中鑒定出四個(gè)推測(cè)的GATA結(jié)合位點(diǎn)（G/A）GATA（A/T）（圖5g）。這些結(jié)合位點(diǎn)的順序缺失和突變揭示GATA結(jié)合位點(diǎn)2（TSS上游的-1,198）是GATA6抑制MIR100HG轉(zhuǎn)錄活性的主要位點(diǎn)（圖5h）。MIR100HG的GATA6抑制也在HuTu80細(xì)胞中得到驗(yàn)證，其具有低表達(dá)的GATA6和高表達(dá)的MIR100HG（補(bǔ)充圖9c，d）。通過使用來自CC細(xì)胞的核提取物的染色質(zhì)免疫沉淀和電動(dòng)移位測(cè)定證實(shí)GATA6在GATA結(jié)合位點(diǎn)2處的染色質(zhì)占據(jù)（補(bǔ)充圖9e，f）。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)GATA6的3'UTR含有miR-125b的推測(cè)結(jié)合位點(diǎn)（補(bǔ)充表5）。在CC和Caco-2細(xì)胞中，miR-125b的引入降低了野生型3'UTR報(bào)道構(gòu)建體的熒光素酶活性，但是當(dāng)miR-125b位點(diǎn)突變時(shí)卻沒有（圖5i和補(bǔ)充圖9g）。如所預(yù)測(cè)的，在穩(wěn)定表達(dá)miR-125b的CC和Caco-2細(xì)胞中GATA6水平降低，并且在表達(dá)miR-125b海綿的CC-CR和HuTu80細(xì)胞中相反地增加（圖5j和補(bǔ)充圖9h）。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步分析顯示，在IV期CRC患者中，GATA6顯著下調(diào)，而MIR100HG顯著上調(diào)（圖5k）。此外，具有較低四分位數(shù)表達(dá)的GATA6的CRC在TCGA數(shù)據(jù)庫中傾向于具有較高的MIR100HG表達(dá)（圖5k），以及另外兩個(gè)CRC數(shù)據(jù)集（補(bǔ)充圖9i）?？傊?，這些研究結(jié)果表明，GATA6，MIR100HG和miR-125b之間的雙負(fù)調(diào)節(jié)通路是西妥昔單抗耐藥的基礎(chǔ)。

6 西妥昔單抗耐藥時(shí)CRC標(biāo)本中MIR100HG，miR-100和miR-125b表達(dá)增加

為了檢查這種西妥昔單抗耐藥模式是否發(fā)生在人類CRC中，我們?cè)谖魍孜魡慰怪委熼_始前和腫瘤進(jìn)展時(shí)從10個(gè)個(gè)體中獲得了成對(duì)的腫瘤標(biāo)本（補(bǔ)充表7）。在用西妥昔單抗治療之前獲得的腫瘤標(biāo)本中排除了KRAS/NRAS/BRAF突變。qRT-PCR顯示，與治療前水平相比，miR-100和miR-125b在治療進(jìn)展的腫瘤中協(xié)同過表達(dá)（rs = 0.842，P <0.01）（P <0.05;圖6a）。此外，在西妥昔單抗上發(fā)展的腫瘤中，核β-catenin免疫反應(yīng)性顯著升高（圖6b）。 miR-125b的表達(dá)與核β-catenin染色直接相關(guān)（rs = 0.636，P <0.05）; miR-100表達(dá)與核β-catenin染色之間的相關(guān)性未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（rs = 0.612，P = 0.06）。與我們的臨床研究結(jié)果相反且一致，在西妥昔單抗上進(jìn)展的腫瘤中核GATA6表達(dá)減少（圖6c）。然而，我們未發(fā)現(xiàn)miR-100和GATA6（rs =-0.455，P = 0.187）或miR-125b和GATA6（rs =-0.515，P = 0.128）之間存在顯著的負(fù)相關(guān)。使用FISH分析，我們發(fā)現(xiàn)MIR100HG，miR-100和miR-125b信號(hào)在治療進(jìn)展的腫瘤中增加。在這些相同的樣品中，β-catenin染色增加并且GATA6染色減少（圖6d）。我們?cè)谒?0個(gè)配對(duì)樣本中排除了通過FISH進(jìn)行的MET擴(kuò)增，并對(duì)治療后腫瘤進(jìn)行了KRAS/NRAS/BRAF突變的測(cè)序（補(bǔ)充圖9j和補(bǔ)充表8）。分別在兩例中檢測(cè)到NRAS和KRAS突變；我們確認(rèn)這些可能是通過對(duì)治療前DNA進(jìn)行重新測(cè)序而獲得的事件。在兩種情況下，MIR100HG，miR-100和miR-125b表達(dá)均增加。在剩余的8例缺乏遺傳耐藥事件的病例中，5例病例在治療后的腫瘤中表現(xiàn)出上調(diào)的MIR100HG，miR-100和miR-125b。這些臨床數(shù)據(jù)支持我們的臨床前研究結(jié)果并證明MIR100HG，miR-100和miR-125b的上調(diào)發(fā)生在CRC患者獲得性西妥昔單抗耐藥的情況下，并且這種上調(diào)可能與基因突變相關(guān)也可能獨(dú)立于與之相關(guān)的基因突變。

4 討論

MIR100HG是一種多順反子miRNA宿主基因，在其第三個(gè)內(nèi)含子中編碼miR-100，let-7a-2和miR-125b-1。首次報(bào)道MIR100HG參與人間充質(zhì)干細(xì)胞的命運(yùn)，后來發(fā)現(xiàn)其在急性巨核細(xì)胞白血病中高度表達(dá)。MIR100HG表達(dá)增加與宮頸癌預(yù)后不良有關(guān)，而其表達(dá)在乳腺癌中由于高甲基化而降低。miR-100和miR-125b的表達(dá)增加也與臨床樣本中的胃癌進(jìn)展相關(guān)。在我們的研究中，伴隨的MIR100HG，miR-100和miR-125b的上調(diào)發(fā)生在CRC和HNSCC細(xì)胞系中獲得性和原發(fā)西妥昔單抗耐藥的處理中。此外，我們發(fā)現(xiàn)這些事件可能與KRAS/NRAS/BRAF突變和西妥昔單抗耐藥的CRC患者腫瘤共同發(fā)生。對(duì)TCGA CRC數(shù)據(jù)庫的分析揭示了MIR100HG表達(dá)的階段依賴性增加。這些數(shù)據(jù)支持MIR100HG，miR-100和miR-125b是西妥昔單抗耐藥的潛在預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的假設(shè)。

我們通過靶向Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的五個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子確定miR-100和miR-125b協(xié)調(diào)地促成西妥昔單抗耐藥。miR-100靶向DKK1和ZNRF3，miR-125b靶向ZNRF3，RNF43，DKK3和APC2。Wnt信號(hào)傳遞受到嚴(yán)格調(diào)控，負(fù)調(diào)控分子在許多不同的層面上發(fā)揮作用。DKK1和DKK3是Dickkopf家族的分泌型Wnt信號(hào)傳導(dǎo)拮抗劑。DKK1通過結(jié)合和內(nèi)化Wnt共受體LRP5/6起作用，而尚不清楚DKK3如何減弱Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。 ZNRF3和RNF43是兩個(gè)密切相關(guān)的跨膜E3泛素連接酶，它通過Wnt受體Frizzled及其共受體LRP5/6的泛素化和降解來拮抗Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。雖然已報(bào)道ZNRF3/RNF43的失活突變，但我們的數(shù)據(jù)表明，miR-100和miR-125b的下調(diào)可能是減弱ZNRF3/RNF43功能的替代機(jī)制。APC2靶向β-catenin，并且在功能上與APC41互補(bǔ)；最近報(bào)道，APC2將TNKS募集到β-catenin破壞復(fù)合物以調(diào)節(jié)β-catenin蛋白水解。我們之前已將APC鑒定為miR-125b在白血病細(xì)胞中的靶標(biāo)，但未檢測(cè)CC或CC-CR中的APC，因?yàn)樗谶@些細(xì)胞中發(fā)生突變。然而，最近報(bào)道m(xù)iR-125b在具有野生型APC43的突變體β-catenin HCT116細(xì)胞中產(chǎn)生APC。我們的研究結(jié)果表明，miR-100和miR-125b共同作用靶向這五種Wnt負(fù)調(diào)節(jié)因子，為聚集的miRNA提供了一種先前未知的調(diào)節(jié)模式，以協(xié)同調(diào)節(jié)該途徑。

我們不能排除miR-100和miR-125b通過除Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之外的方式促成西妥昔單抗耐藥的可能性。例如，miR-125b可通過靶向液泡蛋白分選4同源物B（Vps4b）和間接延長EGFR活性來增強(qiáng)皮膚中的腫瘤形成。然而，我們觀察到CC和CC-CR之間的VPS4b表達(dá)沒有差異。我們還沒有排除全長3-kb MIR100HG轉(zhuǎn)錄物對(duì)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的影響。

我們的研究結(jié)果增加了描述EGFR和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之間串?dāng)_。例如，在APC-突變體CRC中，增加的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)了Wnt活性，支持Wnt信號(hào)傳導(dǎo)在受損的β-catenin降解復(fù)合物的情況下進(jìn)一步調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)。以相反的方式，Wnt配體與其GPCR卷曲蛋白受體的結(jié)合通過金屬蛋白酶依賴性，EGFR配體的細(xì)胞表面胞外域切割導(dǎo)致EGFR反式激活。此外，增加的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)賦予肺癌中EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥。

增加的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)賦予西妥昔單抗耐藥的確切機(jī)制尚不確定。據(jù)報(bào)道，Wnt信號(hào)增加肝臟中的EGFR表達(dá)。我們觀察到西妥昔單抗在CC-CR中沒有降低p-EGFR，pERK1/2或p-AKT，而在CC中則降低。雖然CC和CC-CR中存在相同的細(xì)胞表面EGFR染色，但這并不排除EGFR內(nèi)化，再循環(huán)和降解速率的差異。展望未來，系統(tǒng)范圍的方法應(yīng)該有助于解開在該系統(tǒng)中解決EGFR/Wnt串?dāng)_的機(jī)制。

GATA6在癌癥中的作用是復(fù)雜的，并且依賴于背景；即使在相同的腫瘤類型中，也存在相互矛盾的證據(jù)。例如，GATA6通過激活Wnt信號(hào)促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生。另外的研究發(fā)現(xiàn)，通過維持胰腺分化程序，它可以起到抑制腫瘤的作用。同樣，在結(jié)腸瘤形成中，已經(jīng)報(bào)道了相反的行為。在結(jié)腸腺瘤中，GATA6抑制BMP表達(dá)，從而使干細(xì)胞自我更新，并且在CRC細(xì)胞系中，它增強(qiáng)Lgr5和REG4的表達(dá)以分別促進(jìn)克隆形成和生長。相反，我們的數(shù)據(jù)支持GATA6在CRC中的腫瘤抑制作用。對(duì)TCGA CRC數(shù)據(jù)庫的分析顯示，IV期CRC中GATA6表達(dá)減少，同時(shí)MIR100HG表達(dá)增加。GATA6的表達(dá)降低將允許MIR100HG的表達(dá)增加，并且miR-125b的相應(yīng)增加的表達(dá)將加強(qiáng)GATA6的抑制。在這種情況下，GATA6通過阻止Wnt信號(hào)增強(qiáng)的西妥昔單抗耐藥起到抑制腫瘤作用的作用。

我們的研究結(jié)果對(duì)CRC和HNSCC具有重要的治療意義。越來越多的人認(rèn)識(shí)到CRC56中存在Wnt信號(hào)的梯度，并且可以在APC功能喪失的中調(diào)制Wnt信號(hào)。在我們的模型中，MIR100HG，miR-100-和miR-125b介導(dǎo)的Wnt活化代表通過激活代償途徑適應(yīng)在EGFR抑制下存活的細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)誘導(dǎo)DKK1或DKK3，或重組DKK1和DKK3的組合，克服了CC-CR中的西妥昔單抗耐藥。抑制劑XAV-939和β-catenin CBP抑制劑ICG-001均增強(qiáng)了西妥昔單抗的生長抑制作用。我們建議未來用野生型KRAS/NRAS/BRAF CRC進(jìn)行的個(gè)體試驗(yàn)應(yīng)考慮MIR100HG表達(dá)水平。

總之，我們已經(jīng)通過上調(diào)MIR100HG及其衍生的miRNA來鑒定了西妥昔單抗耐藥的復(fù)雜通路。 miR-100和miR-125b通過減少Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的五種負(fù)調(diào)節(jié)物的表達(dá)來協(xié)調(diào)激活Wnt信號(hào)傳導(dǎo)。miR-125b通過抑制通常抑制MIR100HG的GATA6表達(dá)來加強(qiáng)MIR100HG的上調(diào)。我們發(fā)現(xiàn)抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)可以克服這種西妥昔單抗耐藥模式，強(qiáng)調(diào)了EGFR和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)之間相互作用的潛在臨床相關(guān)性。

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