Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA

一個(gè)保守的癌/睪丸lncRNA THOR的致癌功能

期刊：cell；影響因子：31.398

發(fā)表單位：密歇根大學(xué)轉(zhuǎn)化病理學(xué)中心

導(dǎo)讀

      RNAseq得到差異lncRNA那么多，該如何找到那個(gè)想要的lncRNA? 本研究提供了一個(gè)很好的角度。本研究作者對人類轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行lncRNA保守性分析，發(fā)現(xiàn)了82個(gè)具有超守區(qū)域的lncRNA，而后結(jié)合基因組織表達(dá)特異性，發(fā)現(xiàn)了THOR和CRNDE在睪丸組織中特異性表達(dá)，尤其是THOR特異性很高，其他正常組織幾乎沒有表達(dá)。而后以THOR為對象進(jìn)行研究，根據(jù)RNAseq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其周圍基因沒有顯著變化，證實(shí)其不是通過cis順式調(diào)控臨近基因發(fā)揮作用。作者使用RNA pull-down，而后質(zhì)譜鑒定結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)IGF2BP是其主要結(jié)合蛋白，有報(bào)道稱IGF2BP1也具有睪丸特異性表達(dá)的特征，IGF2BP1與其他一系列蛋白質(zhì)和信使核糖核蛋白（mRNP）復(fù)合物一起介導(dǎo)RNA穩(wěn)定性和翻譯，通過過表達(dá)，敲除THOR，IGF2BP1驗(yàn)證靶標(biāo)mRNA表達(dá)量變化，揭示THOR結(jié)合IGF2BP1與其他蛋白一起形成復(fù)合物調(diào)控靶標(biāo)基因表達(dá)的機(jī)制。

1 摘要

      大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測序大大擴(kuò)展了具有不同進(jìn)化保守性，譜系表達(dá)和癌癥特異性的長非編碼RNA（lncRNA）的分類。在這里，我們功能鑒定了一種新的超保守lncRNA，THOR（ENSG00000226856），僅在睪丸和廣泛的人類癌癥中表現(xiàn)出表達(dá)。多種細(xì)胞系和動物模型中的THOR敲低和過表達(dá)改變了細(xì)胞致癌作用的或腫瘤生長。我們發(fā)現(xiàn)THOR與IGF2BP1具有保守相互作用，THOR有助于IGF2BP1的mRNA穩(wěn)定活性。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因THOR敲除在斑馬魚中產(chǎn)生了受精缺陷，并且還賦予了對黑素瘤發(fā)病的抗性。同樣，斑馬魚中人THOR的異種移植表達(dá)加速了黑素瘤的發(fā)生。THOR代表一類新的功能重要的癌癥/睪丸lncRNAs，其結(jié)構(gòu)和功能經(jīng)歷了積極的進(jìn)化選擇。

2 研究背景

      長非編碼RNA（lncRNA）是一種具有表達(dá)豐富且功能多樣ncRNA，在多種物種出現(xiàn)。盡管它們在轉(zhuǎn)錄組中具有驚人的普遍性以及無數(shù)次研究過其功能，但我們對絕大多數(shù)lncRNA功能的理解仍然是很少，使得它們的分類特別具有挑戰(zhàn)性。新的lncRNA類別繼續(xù)被鑒定，其分類標(biāo)準(zhǔn)主要與其功能作用和保守性相關(guān)。

      盡管lncRNA的普遍保守水平一直存在爭議，但有一個(gè)明確的lncRNA亞類是高度保守的，其中許多具有“超保守”區(qū)域（即，至少200bp的幾乎完美的脊椎動物保守性）。高度保守性提示細(xì)胞功能相關(guān)的特征，也有助于對模式生物中的lncRNA進(jìn)行特征和機(jī)理研究。

      在這里，我們定義了一類新的lncRNA，僅在正常組織睪丸表達(dá)，并在多種類型癌癥中廣泛表達(dá)。這種癌癥/睪丸表達(dá)模式是癌癥/睪丸抗原的特征，癌癥/睪丸抗原是一種明確定義的蛋白質(zhì)類別，已被建議作為癌癥治療的靶標(biāo)。在這里，我們鑒定THOR（睪丸相關(guān)的高度保守的致癌長非編碼RNA）并研究其在腫瘤發(fā)生和睪丸生理學(xué)中的作用，鑒定與IGF2 mRNA結(jié)合蛋白（IGF2BPs）的進(jìn)化上保守的功能性相互作用。 此外，我們將THOR的保守序列生成轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型，揭示其在睪丸和癌癥中的功能。

3 結(jié)果

1 THOR發(fā)現(xiàn)，一種在睪丸中表達(dá)的保守lncRNA

      在最近的大規(guī)模RNA測序（RNA-seq）分析中，我們?nèi)娣治隽巳祟愞D(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)了數(shù)以萬計(jì)的新lncRNA。雖然lncRNAs往往比蛋白質(zhì)編碼基因保守性低（圖S1A），并且大多數(shù)沒有表現(xiàn)出明顯的序列保守性，但確實(shí)存在一組保守的lncRNA（圖1A）。我們測量了整個(gè)轉(zhuǎn)錄本的平均堿基保守性（圖1A，x軸）和最佳200-bp窗口的保守水平（圖1A，y軸），這是先前用于確定超保守元素的測量方法。我們在組織RNA-seq中鑒定了82個(gè)超保守基因間lncRNA，其在1％的樣品中表達(dá)至少1個(gè)FPKM（圖1A和1B以及表S1）。盡管擁有200 bp的超保守片段，但這些lncRNAs具有不同程度的堿基保守性（圖1B，頂部;范圍0.1％-55.4％保守堿基），THOR表現(xiàn)出第二高的堿基保守程度。有趣的是，當(dāng)研究基因型-組織表達(dá)（GTEx）良性組織RNA-seq數(shù)據(jù)集時(shí)，這些超保守的lncRNA中的兩個(gè)，即THOR和CRNDE，在睪丸中顯示出有意義表達(dá)（圖1B，底部）。由于其睪丸特異性表達(dá)模式（圖1C）與CRNDE的混雜表達(dá)（圖S1B）相比，我們進(jìn)一步關(guān)注THOR。

2 轉(zhuǎn)錄THOR同系物存在于小鼠和斑馬魚中

      使用5’和3’快速擴(kuò)增cDNA末端（RACE），我們鑒定了兩種THOR剪接體，由2號染色體上的2或3個(gè)外顯子組成（圖S1C和表S2）。另外，通過H1299人肺腺癌細(xì)胞系中的RNA印跡證實(shí)存在THOR的3-外顯子剪接體（圖S2A）。雖然GENCODE注釋基因具有額外的較大剪接體和下游外顯子，但在該研究中使用的任何細(xì)胞系中均未檢測到該剪接體的表達(dá)（圖S2B），并且THOR靶向siRNA未改變表達(dá)長剪接體（圖S2C）。鑒于其序列保守性，我們嘗試確定其他物種中的THOR同源轉(zhuǎn)錄本。利用BLAST比對工具（BLAT），我們鑒定了小鼠和斑馬魚基因組中與人THOR同源的預(yù)測區(qū)域（h-THOR，Ensemble ID：ENSG00000226856）（圖1D）。另外，我們在小鼠THOR（m-THOR）中證實(shí)了2-外顯子同源轉(zhuǎn)錄本（圖S1D和表S2），并且在斑馬魚THOR（z-THOR）中證實(shí)了2個(gè)單體異構(gòu)體同源轉(zhuǎn)錄本（圖S1E和表S2）。還通過northern印跡檢測到較短的斑馬魚剪接體（圖S2D）。h-THOR的保守性延伸到外顯子2和3，以m-THOR和z-THOR表示（圖1D）。THOR的進(jìn)一步特征分析證實(shí)它是非編碼轉(zhuǎn)錄物（圖S2E-S2G）。

3 THOR在正常組織中表現(xiàn)出進(jìn)化保守的表達(dá)模式

      為了驗(yàn)證GTEx RNA-seq數(shù)據(jù)中觀察到的睪丸特異性THOR表達(dá)，我們用來自各種正常人組織的cDNA進(jìn)行qRT-PCR，觀察類似的睪丸特異性表達(dá)模式（圖2A）。此外，使用h-THOR特異性探針的人睪丸組織的RNA原位雜交（ISH）顯示在睪丸精母細(xì)胞和精子中富集THOR（圖2B），但在周圍組織中沒有（圖S2H和S2I）。有趣地是，THOR的這種表達(dá)模式與在X染色體上未發(fā)現(xiàn)的癌/睪丸抗原報(bào)道的類似表達(dá)模式。從小鼠和斑馬魚的組織中鑒定了m-THOR（圖2C）和z-THOR（圖2D）的睪丸特異性表達(dá)。此外，我們還觀察到在小鼠和斑馬魚的早期發(fā)育期間THOR表達(dá)升高（圖2C和2D，右）。

4 THOR在人類癌癥中的表達(dá)及功能意義

      除了在正常組織中的睪丸特異性表達(dá)外，我們還鑒定了THOR在多種類型癌癥中的表達(dá)，在非睪丸正常組織（圖3A）和許多癌細(xì)胞系中很少表達(dá)，在癌細(xì)胞中過表達(dá)，特別是在肺癌細(xì)胞系中（圖3B）。此外，與正常肺樣本相比，THOR在肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）中表現(xiàn)出顯著的差異表達(dá)（圖3C）。除了qPCR定量黑素瘤和黑素細(xì)胞外，這一癌癥特異性表達(dá)譜在腫瘤和正常肺的獨(dú)立存在中得到證實(shí)（圖3D）。我們通過siRNA和反義寡核苷酸（ASO）在H1299和MM603，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和具有高水平表達(dá)THOR的黑素瘤細(xì)胞系中進(jìn)行THOR敲低（圖3E，S3A和S3B）觀察到這些細(xì)胞的增殖能力戲劇性降低（圖3F，3G，S3C和S3D）。H1437細(xì)胞中的THOR的siRNA和ASO敲低（缺乏內(nèi)源性THOR表達(dá)；圖3E）未顯示出顯著的增殖表型（圖S3E和S3F）。通過ASO和siRNA敲低（圖3H和S3G-S3I）和siRNA敲低（圖S3H），THOR敲低導(dǎo)致軟瓊脂中的克隆群落形成減少。

      此外，我們通過CRISPR-Cas9技術(shù)生成THOR敲除細(xì)胞系模型，其中雙鏈single-guide RNAs（sgRNA）靶向H1299細(xì)胞系中THOR轉(zhuǎn)錄本的保守區(qū)域。使用多個(gè)sgRNA，靶向不同的THOR區(qū)域（圖S3J），并選擇具有穩(wěn)定敲除的單克隆群用于進(jìn)一步分析（圖S3K和S3L）。THOR敲除的H1299細(xì)胞表現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞增殖（圖3I），表型恢復(fù)，異常表達(dá)THOR（圖3I）。這些結(jié)果也在敲除克隆的斑塊群中出現(xiàn)，表明單克隆的不是由于選擇偏倚原因（圖S3M-S3O）。進(jìn)一步證實(shí)了靶向效應(yīng)，H1437細(xì)胞中的THOR斑塊敲除（圖S3P）沒有導(dǎo)致增殖減少（圖S3Q）。此外，與對照敲除細(xì)胞相比，含有THOR敲除的H1299細(xì)胞的小鼠異種移植物顯示出顯著減少的腫瘤生長（圖3J）。

      在H1437和SKMEL5中具有穩(wěn)定的慢病毒THOR過表達(dá)的細(xì)胞（圖S3R）顯示出增殖能力（圖3K和S3S）和軟瓊脂群落形成（圖3L和S3T）的顯著增加。另外，與穩(wěn)定過表達(dá)LacZ對照的細(xì)胞相比，H1437細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)THOR的細(xì)胞的鼠腫瘤異種移植物表現(xiàn)出顯著的增殖能力（圖3M）。然而，這一發(fā)現(xiàn)在使用SMKEL5細(xì)胞的小鼠異種移植物中并不顯著（圖S3U）。通過Northern印跡對慢病毒質(zhì)粒的分析顯示，除了質(zhì)粒中包含的剪接體外，還有其他的THOR長剪接體（圖S2A）。5’和3’RACE鑒定了較長剪接體中表達(dá)的一段質(zhì)粒（圖S2J和S2K）；然而，THOR靶向siRNA確實(shí)降低了這種剪接體的水平，表明這種較長剪接體的功能保守性（圖S2A）。

5 THOR-IGF2BP1相互作用分析

      細(xì)胞分解后通過qRT-PCR進(jìn)行的THOR細(xì)胞定位揭示了細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的表達(dá)（圖S4A），這一發(fā)現(xiàn)得到了單分子熒光ISH的證實(shí)（圖S4B-S4H）。為了進(jìn)一步在功能上分析THOR，我們通過pull-down，質(zhì)譜鑒定了潛在的THOR蛋白質(zhì)相互作用物。根據(jù)THOR的序列保守性，我們利用多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件來鑒定保守的結(jié)合片段：（1）加入人H1299癌細(xì)胞裂解物pull-down h-THOR，（2）加入斑馬魚胚胎裂解物pull-down h-THOR，（3）向人H1299癌細(xì)胞裂解物中加入z-THOR的pull-down，和（4）向斑馬魚胚胎裂解物中加入z-THOR的pull-down（表S3）。在所有條件下，反義THOR的pull-down被用作陰性對照。在所有四種條件下pull-down兩種蛋白質(zhì)IGF2BP1和IGF2BP3（圖4A）。有趣的是，在H1299細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)組分中，IGF2BP蛋白也是h-THOR pull-down的唯一蛋白質(zhì)（圖S4I），據(jù)報(bào)道IGF2BP1表現(xiàn)出類似于癌癥/睪丸的表達(dá)模式（圖S4J和S4K）。

      IGF2BP1與其他一系列蛋白質(zhì)與信使核糖核蛋白（mRNP）復(fù)合物一起介導(dǎo)RNA穩(wěn)定性和翻譯。在各種條件下通過THOR pull-down mRNP復(fù)合物的多個(gè)組分（圖4A），并且我們通過免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡證實(shí)IGF2BP1，IGF2BP2，IGF2BP3和YBX1存在于復(fù)合物中（圖4B）。用針對IGF2BP1-3，YBX1，STAU1和HuR的抗體進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP）測定，然后對THOR和其他對照RNA進(jìn)行qRT-PCR，證實(shí)了THOR-IGF2BP1相互作用的特異性（圖4C）。此外，H1437中THOR的過表達(dá)導(dǎo)致IGF2BP1和IGF2BP3相互作用的適度增加，表明THOR在介導(dǎo)mRNP復(fù)合物形成中的潛在作用（圖S4L）。

      THOR和IGF2 RNA被mRNP復(fù)合物的各種蛋白質(zhì)pull-down，而陰性對照lncRNAs NEAT1，TINCR和HOTAIR表現(xiàn)出顯著降低的pull-down程度（圖4C）。盡管如此，HuR一種不在mRNP復(fù)合物中的蛋白質(zhì)（圖4B）不會降低這些RNA（圖4C），盡管通過免疫印跡確認(rèn)了強(qiáng)烈的pull-down（圖4B）。通過向純化的myc標(biāo)記的IGF2BP1添加體外轉(zhuǎn)錄的h-THOR證實(shí)了THOR和IGF2BP1的直接結(jié)合相互作用（圖4D）。

      pull-down h-THOR的各種缺失剪接體，然后對IGF2BP1進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，揭示負(fù)責(zé)IGF2BP1結(jié)合的THOR區(qū)域位于外顯子2和3中，即h-THOR的保守區(qū)域（圖4E）。此外，還觀察到z-THOR的結(jié)果，其中z-THOR的5’端保守部分足以引起斑馬魚igf2bp1蛋白的pull-down（圖4F）。 IGF2BP1具有2個(gè)RNA識別序列（RRM）結(jié)構(gòu)域和4個(gè)Khomology（KH）結(jié)構(gòu)域（圖S4M）。使用IGF2BP1的多種重組缺失蛋白，我們發(fā)現(xiàn)RRM結(jié)構(gòu)域的缺失不影響THOR結(jié)合，而發(fā)現(xiàn)KH1，KH3和KH4結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥HOR結(jié)合是必需的（圖S4N）。

6 THOR調(diào)節(jié)IGF2BP1的目標(biāo)mRNA水平

      據(jù)報(bào)道，IGF2BP1可調(diào)節(jié)靶RNA的mRNA穩(wěn)定性（IGF2，CD44，KRAS，ACTB， PABPC1，GLI1，MYC，MAPT，CTNNB1，PPP1R9B，BTRC，PTEN和H19）。值得注意的是，在H1299和MM603細(xì)胞中THOR的敲低后，幾乎所有IGF2BP1靶標(biāo)的水平均降低，而在H1437和SKMEL5細(xì)胞中THOR的穩(wěn)定過表達(dá)則相反地增加（圖5A和S5A）。正如預(yù)期的那樣，IGF2BP1的敲低產(chǎn)生了其靶標(biāo)的減少，而改變IGF2和CD44 2個(gè)經(jīng)典IGF2BP1靶標(biāo)水平，未能顯示出IGF2BP1靶標(biāo)的表達(dá)趨勢（圖5A）。CRISPR介導(dǎo)的THOR敲除H1299細(xì)胞表現(xiàn)出類似的IGF2BP1靶標(biāo)表達(dá)減少，當(dāng)在這些細(xì)胞中表達(dá)異常THOR時(shí)表型逆轉(zhuǎn)，表明THOR的反式調(diào)控功能（圖S5B）。

      我們假設(shè)THOR水平對IGF2BP1靶標(biāo)的影響（圖5A）可以通過THOR介導(dǎo)的IGF2BP1與其靶標(biāo)相互作用的穩(wěn)定性來解釋。證實(shí)這一假設(shè)，IGF2BP1靶向IGF2和CD44的qRT-PCR，在THOR敲低背景下IGF2BP1 RIP后，IGF2和CD44的IGF2BP1結(jié)合減少，而THOR的過表達(dá)增加IGF2和CD44結(jié)合。 IGF2和CD44的敲低未產(chǎn)生相同的結(jié)果（圖5B和S5C）。另外，在放線菌素D處理后，THOR過表達(dá)顯著增加IGF2BP1靶向IGF2和CD44的mRNA穩(wěn)定性（圖5C），而對GAPDH和UBC的穩(wěn)定性沒有影響，GAPDH和UBC是兩種不與IGF2BP1相互作用的對照mRNA（圖S5D）。THOR mRNA的半衰期為14小時(shí)（圖S5E），其長于觀察到對IGF2和CD44穩(wěn)定作用的動態(tài)范圍（圖5C和S5D），證實(shí)THOR存在于細(xì)胞中足以發(fā)揮這些效果。

      除了改變IGF2水平（圖5A）和調(diào)節(jié)IGF2-IGF2BP1結(jié)合（圖5B）之外，THOR還成功調(diào)節(jié)IGF2的下游信號傳導(dǎo)途徑（圖S5A和S5F），表明THOR介導(dǎo)的IGF2BP1靶標(biāo)表達(dá)變化足以功能性改變下游IGF2信號傳導(dǎo)。此外，THOR過表達(dá)所賦予的增殖優(yōu)勢通過降低這些細(xì)胞中的IGF2BP1水平而消除，在SKMEL5細(xì)胞系中具有特別顯著的表型（圖5D），進(jìn)一步證實(shí)了THOR-IGF2BP1相互作用的功能相關(guān)性。另外，H1299和MM603細(xì)胞中IGF2BP1的敲低降低了細(xì)胞增殖（圖S5G和S5H）和軟瓊脂群落形成（圖S5I和S5J）。缺乏保守的IGF2BP1結(jié)合序列的THOR缺失構(gòu)建體的過表達(dá)未能表現(xiàn)出在全長THOR過表達(dá)中觀察到的增強(qiáng)的增殖能力（圖5E）。這些數(shù)據(jù)表明THOR和IGF2BP1之間的結(jié)合相互作用與細(xì)胞功能相關(guān)，這些作用結(jié)果對THOR的致癌性有影響。

      為了更廣泛地評估與IGF2BP1敲低相比的THOR敲低的轉(zhuǎn)錄表型，評估了用靶向THOR，IGF2BP1和HUR的兩種獨(dú)立siRNA進(jìn)行的RNA-seq的差異表達(dá)。我們觀察到在THOR和IGF2BP1敲低時(shí)具有重疊的差異表達(dá)基因（圖6A和6B）。證實(shí)通過siRNA敲低觀察到的基因表達(dá)變化是靶向效應(yīng)，通過兩個(gè)獨(dú)立的ASO敲低THOR導(dǎo)致基因表達(dá)變化與通過siRNA敲低產(chǎn)生的那些一致（圖S6A）。然而，作為陰性對照，敲低HUR并沒有檢測到這些基因表達(dá)變化。在敲除THOR和IGF2BP1時(shí)最大改變的基因也是高度一致的（Pearson r = 0.50;圖6C）。然而，HUR敲除后的基因變化特征與THOR（圖S6B）或IGF2BP1（圖S6C）敲低后的基因變化無關(guān)。有趣的是，與黑素瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)相關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立基因特征是IGF2BP1和THOR敲低后改變的最重要基因特征之一（圖圖6C），進(jìn)一步暗示THOR-IGF2BP1在癌癥進(jìn)展中的關(guān) - 特別是在黑素瘤中。

      為了進(jìn)一步揭示THOR和IGF2BP1的功能關(guān)系，我們進(jìn)行了IGF2BP1 iCLIP。在過表達(dá)THOR的H1437細(xì)胞中，在通過缺失構(gòu)建體pull-down鑒定的相同區(qū)域中觀察到IGF2BP1對THOR的結(jié)合（圖4E），而在過表達(dá)LacZ對照的H1437細(xì)胞中未觀察到結(jié)合（圖S6D）。通過iCLIP將185個(gè)基因鑒定為IGF2BP1結(jié)合靶標(biāo)，并且通過RNA-seq測量，觀察到這些基因與不是IGF2BP1靶標(biāo)的基因相比具有顯著的表達(dá)增加（圖S6E和S6F）。另外，H1299中的IGF2BP1 iCLIP證實(shí)了IGF2BP1與THOR結(jié)合的定位（圖S6G）。如上所述，與沒有IGF2BP1結(jié)合的基因相比，在H1299 iCLIP實(shí)驗(yàn)中鑒定為IGF2BP1的結(jié)合靶標(biāo)的基因表現(xiàn)出THOR敲低時(shí)表達(dá)的顯著降低，盡管效果的程度小于H1437實(shí)驗(yàn)（圖S6H和S6I）。這些高通量數(shù)據(jù)證實(shí)THOR在介導(dǎo)IGF2BP1靶標(biāo)的RNA穩(wěn)定性中的潛在影響。進(jìn)一步利用這些數(shù)據(jù)，THOR的順式調(diào)控功能被排除掉，THOR表達(dá)水平改變時(shí)，THOR附近的基因沒有表現(xiàn)出顯著表達(dá)量變化（圖S6J）。

7 THOR-Knockout斑馬魚表現(xiàn)出受精缺陷和對黑色素瘤形成抵抗力

      鑒于我們觀察到THOR的序列保守性（圖1A，1B，1D和S1C-S1E），保守的組織表達(dá)模式（圖2A，2C和2D），以及其與IGF2BP1的結(jié)合相互作用的保守性（圖4E和4F），我們開始在不同的動物模型中研究THOR的潛在功能，擴(kuò)展其功能對人癌細(xì)胞系的影響（圖3和4）。斑馬魚動物模型最近成為癌癥研究的相關(guān)模型系統(tǒng)。利用CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)，我們制備了THOR-knockout斑馬魚系。將靶向z-THOR保守區(qū)域（圖S7A）和Cas9 mRNA的兩個(gè)sgRNA注射到斑馬魚胚胎中，產(chǎn)生斑塊F0生成，隨后與野生型斑馬魚交配以產(chǎn)生雜合F1后代（THOR +/-）。然后將雜合子彼此交配以在F2代中產(chǎn)生純合THOR-敲除斑馬魚（THOR-/-）的群體（圖7A）。

      獲得THOR -/-斑馬魚后，我們觀察到與野生型斑馬魚相比，THOR-/-斑馬魚的生育能力有顯著的表型變化，其中55％的THOR-/-斑馬魚交配胚胎在受精后6小時(shí)死亡而野生型交配的比例僅為11％（圖7B）。此外，當(dāng)將野生型雄性與雌性THOR-/-斑馬魚交配時(shí)，受精缺陷大大減少，而將野生型雌性交配到雄性THOR -/-斑馬魚則在斑馬魚后代產(chǎn)生顯著的受精缺陷（圖7C），THOR在睪丸中的作用，提示THOR在生育中的主要功能作用。此外，發(fā)現(xiàn)THOR在減數(shù)分裂II中的精母細(xì)胞表達(dá)，其水平遠(yuǎn)高于任何其他發(fā)育階段的精子（圖7D），并且與野生型斑馬魚相比，THOR-/-斑馬魚的睪丸在減數(shù)分裂II中含有較少的細(xì)胞（圖S7C和S7D）。值得注意的是，在THOR敲低后（圖6C，S6B和S6C），表達(dá)量改變基因多與減數(shù)分裂相關(guān)（圖S7E和S7F）。在這些特征中，我們觀察到在減數(shù)分裂中涉及的組蛋白基因上調(diào)的顯著優(yōu)勢。在THOR敲低后，許多這些減數(shù)分裂組蛋白基因被鑒定為一些最積極失調(diào)的基因（圖S7G）。雖然THOR在生育中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步闡明，但我們已經(jīng)證明THOR在某些睪丸細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空定位，特別是在減數(shù)分裂II期間，并且已經(jīng)證明了由THOR調(diào)節(jié)的那些基因也與減數(shù)分裂有關(guān)的確鑿證據(jù)。

      利用斑馬魚模型進(jìn)一步研究THOR在腫瘤發(fā)生中的作用，我們分析了斑馬魚胚胎的基因表達(dá)。與野生型胚胎相比，THOR-/-斑馬魚胚胎中IGF2BP1靶標(biāo)的表達(dá)降低，并且在過表達(dá)的h-THOR的斑馬魚胚胎中igf2a和igf2b的表達(dá)增加（圖7E）。此外，為了進(jìn)一步研究THOR的體內(nèi)功能，我們制備了斑馬魚黑色素瘤模型，該模型采用胚胎注射由mitfa啟動子（黑素細(xì)胞中表達(dá)的斑馬魚基因）驅(qū)動的人NRAS-K61，形成易于看見的斑馬魚黑色素瘤（圖7A）。使用這種NRAS黑素瘤系統(tǒng)，我們觀察到THOR-/-斑馬魚對黑色素瘤形成的顯著抗性（圖7F）。值得注意的是，雖然之前的斑馬魚黑色素瘤NRAS61K模型需要p53突變體背景來進(jìn)行腫瘤發(fā)生，但我們在單細(xì)胞胚胎中注入大量NRAS61K/Tol2時(shí)觀察到p53野生型斑馬魚的腫瘤生長（5 ng / uL）。我們在p53野生型環(huán)境中產(chǎn)生腫瘤的能力可能是由于F0斑塊現(xiàn)象和Tol2系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因效率的提高。THOR介導(dǎo)的受精缺陷和對黑色素瘤的抗性為THOR在脊椎動物生理學(xué)和病理生理學(xué)中的保守作用提供了令人信服的證據(jù)。

8 人類THOR增強(qiáng)斑馬魚黑色素瘤形成

      為了進(jìn)一步研究THOR在斑馬魚黑色素瘤發(fā)展中的作用，我們利用mitfa啟動子驅(qū)動的注射方法，注射mCherry作為陰性對照，評估了人類THOR添加到斑馬魚胚胎中的功能（圖7G）。對p53敲除（p53-/-）斑馬魚進(jìn)行注射以增強(qiáng)如前所述觀察到的黑素瘤表型。在該模型中，胚胎注射較低濃度的NRAS61K / Tol2（2.5ng / uL）與THOR敲除模型相比（圖7A和7F），導(dǎo)致更弱的表型（圖7H），盡管p53丟失。然而，我們研究表明在THOR過表達(dá)的情況下p53的缺失顯著降低了tumor-free存活率（圖S7B）。斑馬魚中h-THOR的過表達(dá)足以顯著增加黑素瘤發(fā)展的產(chǎn)生（圖7H），但也顯著增加黑素瘤腫瘤的大?。▓D7I和7J）。在p53-/-和野生型斑馬魚（圖7J，S7I和S7K）中NRAS 61K誘導(dǎo)的黑素瘤對Melan-A（人類標(biāo)本中的mitf靶基因和黑素瘤標(biāo)記物）染色呈陽性，證實(shí)病變實(shí)際上是黑素瘤（圖S7J和S7L）。因此，人類同源轉(zhuǎn)錄本THOR促進(jìn)斑馬魚黑色素瘤的顯著能力證明了THOR在介導(dǎo)可能參與腫瘤發(fā)展中的進(jìn)化保守作用。

4 討論

      我們發(fā)現(xiàn)第一個(gè)癌癥/睪丸lncRNA，THOR鑒定為具有癌癥/睪丸表達(dá)模式的lncRNA，其表現(xiàn)出與IGF2BP1的保守相互作用，可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生。我們定義了一類新的lncRNA，可以提供對癌癥生物學(xué)理解的深入了解，并且與其他癌癥/睪丸抗原一致，這一新的lncRNA可能為未來的癌癥治療方法的發(fā)展提供潛力。 lncRNAs在人類轉(zhuǎn)錄本中非常豐富，但對于大多數(shù)lncRNA在細(xì)胞中起作用的方式知之甚少。因此，在本研究中，我們旨在定義一類新的lncRNA，并對其在細(xì)胞中的功能相關(guān)性進(jìn)行徹底調(diào)查。因此，我們實(shí)施了重要的進(jìn)化保守分析，THOR（圖1A和1B）的選擇標(biāo)準(zhǔn)，以便利用動物模型強(qiáng)有力地研究其在細(xì)胞中的作用。通過在人類，小鼠和斑馬魚中觀察到的睪丸特異性組織表達(dá)模式，THOR呈現(xiàn)出具有進(jìn)化保守功能的可能性，增強(qiáng)了其在許多脊椎動物物種中發(fā)揮重要作用的可能性（圖2A，2C和2D）。其他有趣的癌癥/睪丸lncRNA可能不存在高度保守，并為未來的研究提供了一條令人興奮的途徑。為了達(dá)到確定THOR保守功能的目標(biāo)，我們確定了人類和斑馬魚細(xì)胞中人類THOR和斑馬魚THOR的蛋白質(zhì)結(jié)合相互作用（圖4A）。該方法提供了一種有效的方法來鑒定THOR-IGF2BP1相互作用，因?yàn)樗鼈冊诙喾N脊椎動物物種中是保守的。據(jù)報(bào)道，lncRNA與RNA結(jié)合蛋白（RBPs）的結(jié)合是普遍的，并且已經(jīng)進(jìn)行了多種研究來證實(shí)lncRNA-RBP相互作用。然而，在這項(xiàng)研究中，我們揭示了THOR與IGF2BP1的保守相互作用，這在以前沒有報(bào)道過。雖然lncRNA序列和功能的保守性仍然是研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域，但保守的lncRNA-蛋白質(zhì)相互作用（例如THOR）的例子將有助于進(jìn)一步促進(jìn)我們對lncRNA的功能性理解。我們可以使用其他RNAi方法獲得THOR敲除細(xì)胞系，能夠證實(shí)的THOR介導(dǎo)的強(qiáng)大的功能表型。 CRISPR介導(dǎo)的敲除結(jié)果與RNAi基本一致，表明THOR的大部分功能是由RNA分子本身介導(dǎo)的，而不一定是其基因組位置。然而，CRISPR敲除結(jié)果和RNAi結(jié)果之間的微小差異可能是THOR基因座在轉(zhuǎn)錄本功能之外的另外作用的證據(jù)。

      我們隨后揭示THOR協(xié)助IGF2BP1調(diào)節(jié)多個(gè)mRNA靶標(biāo)（圖5A），可能通過調(diào)節(jié)IGF2BP1結(jié)合這些靶標(biāo)的能力（圖5B）并可能調(diào)節(jié)它們的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性（圖S6E-S6I）。研究表明，這種THOR-IGF2BP1關(guān)系與THOR過表達(dá)觀察到的癌癥增殖表型有關(guān)（圖5D和5E）。mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)通過它們與各種RBP的相互作用而緊密控制。IGF2BPs幾乎僅在細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)域中觀察到，其中它們與細(xì)胞質(zhì)mRNPs中的靶mRNA結(jié)合并在mRNA調(diào)節(jié)中起重要作用。我們在這項(xiàng)研究中表明，THOR與IGF2BP1結(jié)合并調(diào)節(jié)廣泛的靶mRNA穩(wěn)定性。鑒于IGF2BP-RNA復(fù)合物在體外具有令人驚訝的長半衰期，THOR可能在促進(jìn)''穩(wěn)定''蛋白-RNA復(fù)合物形成中具有潛在作用，盡管進(jìn)一步需要實(shí)驗(yàn)來確定精確的機(jī)制。值得注意的是，IGF2BPs已被證明主要定位于細(xì)胞質(zhì)。因此，THOR的細(xì)胞質(zhì)和核定位表明THOR在其與IGF2BP1相互作用之外的潛在功能。

      雖然動物模型已被用于研究lncRNA，但我們首次對使用ze-brafish癌測定的致癌lncRNA進(jìn)行了研究（圖7A）。此外，許多這些先前的研究僅限于研究人類中很少組織表達(dá)的lncRNA。然而，THOR在多種物種中表達(dá)，并且在人類癌癥中廣泛表達(dá)（圖3A），提高了它與我們對人類正常和疾病過程的理解的相關(guān)性。研究顯示斑馬魚THOR的敲除導(dǎo)致異常受精（圖7B和7C），此功能針對雄性睪丸，并且還顯示THOR的敲除產(chǎn)生對黑素瘤形成的抗性（圖7F），暗示z-THOR在斑馬魚中的功能。有趣的是，我們還表明，人類THOR能夠利用斑馬魚細(xì)胞機(jī)制產(chǎn)生顯著的癌癥表型（圖7H和7I）。 THOR的這種跨物種功能引起了人們的興趣，表明它的序列和功能都是進(jìn)化選擇的。研究高度保守的lncRNA如THOR闡明了lncRNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵機(jī)制，并且隨著科學(xué)界繼續(xù)研究大量未經(jīng)研究的新型lncRNAs，這里提出的斑馬魚癌癥模型系統(tǒng)提供了一個(gè)可以使用的強(qiáng)大平臺用于進(jìn)一步研究lncRNA功能。

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