更多
相關(guān)文獻(xiàn)
相關(guān)文獻(xiàn)
The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling
The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling
長鏈非編碼RNA lncTCF7通過激活Wnt信號通路促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新
期刊：Cell Stem Cell；影響因子：23.290
發(fā)表單位：中國科學(xué)院生物物理研究所
導(dǎo)讀
lncRNA重要功能機(jī)制之一，可以發(fā)揮cis作用，調(diào)控臨近基因表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌干細(xì)胞基因間lncTCF7招募SWI/SNF復(fù)合物（染色質(zhì)重塑復(fù)合物）與鄰近基因TCF7（T細(xì)胞因子7）啟動子結(jié)合，上調(diào)TCF7轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)而激活Wnt通路促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新和維持。
1 摘要
Hepatocellular carcinoma (HCC) 是肝癌中最普遍的一種類型，具有高復(fù)發(fā)率和高異質(zhì)性。肝細(xì)胞癌干細(xì)胞(CSCs)可能參與這些致病過程，但其自我更新和維持的機(jī)制并不清楚。本研究，使用轉(zhuǎn)錄組微陣列分析，我們鑒定了一個長鏈非編碼RNA，命名為lncTCF7，在肝癌干細(xì)胞、肝癌腫瘤中高表達(dá)。lncTCF7在肝癌干細(xì)胞的自我更新和腫瘤進(jìn)展中是需要的。機(jī)制上，lncTCF7可以招募SWI/SNF復(fù)合物結(jié)合到基因TCF7的啟動子區(qū)調(diào)控TCF7的表達(dá)，引起Wnt通路激活。我們數(shù)據(jù)顯示，lncTCF7介導(dǎo)的Wnt通路促進(jìn)了肝癌干細(xì)胞的自我更新和腫瘤進(jìn)展?？傊?，我們鑒定了基于lncRNA的Wnt通路調(diào)控，促進(jìn)肝癌干細(xì)胞致癌活性，提示lncRNAs可以在腫瘤生長和擴(kuò)散中發(fā)揮作用。
2 研究背景
肝癌是第五大最容易發(fā)生的癌，并在男性中致死率第二。肝細(xì)胞癌是肝癌中最普遍的癌，約占70%–85%。不幸的是5年生存率依舊很低，每年約有75萬肝癌患者死亡。盡管以前在肝癌中鑒定到許多異常表達(dá)的基因，新的分子，但依舊需要繼續(xù)新的診斷和風(fēng)險(xiǎn)評估分子。也需要增加對肝細(xì)胞癌致病機(jī)制的理解，以開發(fā)新的治療方法。高復(fù)發(fā)和高異質(zhì)性是肝癌的最大特點(diǎn)。近期研究顯示異質(zhì)性是干細(xì)胞/先祖細(xì)胞（肝癌干細(xì)胞）分層表達(dá)的結(jié)果。這種腫瘤組織中干細(xì)胞能夠自我更新、分化、生成新的腫瘤，在不同分層中生成不同的癌細(xì)胞，引起高復(fù)發(fā)率。肝癌干細(xì)胞表面有許多markers如上皮細(xì)胞黏附分子 (EpCAM), CD133, CD13, CD90, CD44, CD24, 和鈣通道a2d1亞基。然而，肝癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制仍不清楚。
lncRNAs是一類長度大于200nt的轉(zhuǎn)錄本部分具有5’帽子和3’polyA尾，但不能翻譯蛋白。lncRNAs在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，可以通過機(jī)制以cis 或 trans方式調(diào)控基因表達(dá)。lncRNA參與多種生物學(xué)過程。癌中，報(bào)道稱lncRNAs可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要分子，常與染色質(zhì)重塑復(fù)合物合作。SWI/SNF是進(jìn)化保守的一種多亞基復(fù)合物可以驅(qū)動核小體，利用ATP水解重塑染色質(zhì)。SWI/SNF復(fù)合物與轉(zhuǎn)錄因子，激活因子，抑制因子結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。許多癌中鑒定到SWI/SNF亞基抑制激活的突變，說明個別亞基的突變會促進(jìn)癌的發(fā)生。而且SWI/SNF有報(bào)道能夠控制哺乳動物干細(xì)胞哦自我更新和分化。但SWI/SNF復(fù)合物在肝癌干細(xì)胞中的作用研究較少。本研究，我們發(fā)現(xiàn)lncTCF7是胞癌干細(xì)胞自我更新和維持所需要的。lncTCF7可以招募SWI/SNF促進(jìn)TCF7表達(dá)，引起Wnt通路激活，進(jìn)而促進(jìn)胞癌干細(xì)胞自我更新。
3 材料方法
1 細(xì)胞系和試劑
肝癌細(xì)胞系Hep3B, Huh7 and PLC/PRF/5由Dr. Zeguang Han提供。細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基上，并添加10%胎牛血清，100μg/ml，青霉素G，100 U/ml 鏈霉素。用到的抗體有藻紅蛋白(PE)-anti-human CD133，PE-anti-human IgG，fluorescein isothiocyanate（異硫氰酸熒光素）(FITC)-anti-human CD13，F(xiàn)ITC-anti-human IgG，兔anti-humanTCF7，兔anti-human BAF170，小鼠anti-human Sox2，小鼠anti-human BRG1 ，小鼠anti-human SNF5，兔anti-human CCND2，小鼠anti-human SNF5，兔nti-human CCND2，小鼠anti-human Ki67，小鼠anti-β-actin。
2 病人和樣品收集
本研究招募37個肝切除術(shù)得到的原發(fā)肝癌病人，經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生對腫瘤或活檢組化進(jìn)行診斷。14個肝硬化組織和8個正常肝組織用于對照。通過肝移植組化或CT/MRI結(jié)果診斷為肝硬化。所有組織樣品已獲準(zhǔn)病人同意并得到倫理委員會允許。病人臨床數(shù)據(jù)如Table S1。
3 腫瘤成球?qū)嶒?yàn)
細(xì)胞種植在超低吸附培養(yǎng)皿上，無血清培養(yǎng)。DMEM/F12無血清培養(yǎng)基包含2 mM左旋谷酰胺，1% 丙酮酸鈉，100μg/ml 青霉素G，100 U/ml 鏈霉素，20 ng/ml上皮生長因子，10 ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子2，N2，B27。肝癌干細(xì)胞生長在CO2溫箱中1-2周。立體顯微鏡對腫瘤成球細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
4 流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞分選
使用不同的抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色。FACSCalibur檢測標(biāo)記的細(xì)胞。對于細(xì)胞分選，藻紅蛋白(PE)-anti-human CD133和異硫氰酸熒光素(FITC)-anti-human CD13與肝癌細(xì)胞或肝癌原代細(xì)胞，使用FACS Aria III進(jìn)行分選。
5 HTA 2.0轉(zhuǎn)錄組微陣列實(shí)驗(yàn)
Trizol提取Hep3B, Huh7, and PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞系CD133+CD13+ and CD133-CD13-細(xì)胞total RNA，并提取肝癌臨床樣品shCtrl和shlncTCF7腫瘤成球細(xì)胞。依據(jù)Affymetrix說明書對250ng total RNA使用Ambion® WT Expression Kit進(jìn)行cDNA生物素標(biāo)記。標(biāo)記后，GeneChip Human Transcriptome Array 2.0微陣列與5.5ug cDN 45℃雜交16h。Affymetrix Fluidics Station 450沖洗GeneChips使其褪色。然后使用Affymetrix® GeneChip Command Console進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。Robust Multichip Analysis使用默認(rèn)參數(shù)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。
6 RACE實(shí)驗(yàn)
使用Platinum Taq High-Fidelity聚合酶擴(kuò)增RACE PCR產(chǎn)物，RACE引物如下5' RACE-outer: 5’-CCATCCTGGCTGAACTTTGG -3’, 5' RACE-inner: 5’-TGGACCTGAGCTAACTCCTG-3’; 3' RACE-outer: 5’-CACATGTAGGGGGTACCTTC-3’; 3' RACE-inner: 5’-GGAACACAGTGGCGCACAGG-3’。1.5%瓊脂糖凝膠RACE PCR產(chǎn)物分離。Gel Extraction kit提取分析產(chǎn)物，克隆入pMD18-T載體中，M13 forward and reverse primers進(jìn)行雙向測序。
7 shRNA干擾
MIT's siRNA designer (http://sirna.wi.mit.edu/home.php) 設(shè)計(jì)針對于lncTCF7, TCF7 and BAF170的shRNAs。每個基因設(shè)計(jì)4條，效率最高的shRNAs用于后續(xù)分析。序列如下：lncTCF7 1#: 5'-AGCCAACATTGTTGGTTAT-3', 2# 5'-CACCTAGGTGCTCACTGAA-3'; TCF7: 5'-ATGCTGTACATGAAGGAGA-3'; BAF170: 5'-CAAACTACTAGGGAAATTA-3'。lncTCF7, TCF7, BAF170的shRNA及對照發(fā)夾克隆入pSICO R載體。依據(jù)RNAi consortium (http://www.broadinstitute.org/rnai/trc) 說明書將慢病毒載體轉(zhuǎn)染到肝癌干細(xì)胞中。培養(yǎng)細(xì)胞24h，嘌呤霉素處理5天篩選陽性細(xì)胞，而后收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)或RNA分析。
8 lncTCF7過表達(dá)分析
將lncTCF7 cDNA全長克隆入pCDNA3.1載體，按照之前的方法轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。G418挑選穩(wěn)定的克隆，DNA測序確認(rèn)。
9 裸鼠腫瘤異種移植實(shí)驗(yàn)
不同濃度contrl和treated細(xì)胞皮下注射到裸鼠(male BALB/c nude mice) ，小鼠年齡4-6周，兩邊后背側(cè)區(qū)均有支架。(n=6 to 12每組) 。每隔一天測量腫瘤大小。小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)。
10 免疫印記分析
在有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中裂解細(xì)胞。 通過SDS-PAGE分離細(xì)胞質(zhì)或核蛋白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將其與一抗孵育，然后與辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯示信號。
11 RNA免疫沉淀（RIP）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測定
使用Millipore EZ-Magna RIP RNA-binding protein immunoprecipitation kit進(jìn)行RIP測定。簡而言之，按照之前描述過（Rinn et al., 2007）使用total RNA作為對照，通過qRT-PCR分析RIP產(chǎn)物。每次qRT-PCR反應(yīng)使用了1/150體積的RIP RNA產(chǎn)物。每次RIP反應(yīng)使用5抗體。如前所述（Xia et al.，2013）進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR定量ChIP富含的TCF7啟動子，使用以下引物：F：5'-GAGGGAGAGGCGTCCAATAC-3'，R：5'-GCTCCCCTAGCAGGTTTCTG -3'。
12 定量實(shí)時PCR（qRT-PCR）測定
根據(jù)說明使用書使用TRIzol和RNeasy試劑盒分離total RNA，DNase I進(jìn)行消化。使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物從total RNA中合成cDNA。qRT-PCR在ABI7300實(shí)時PCR系統(tǒng)（ABI 7300，Applied Biosystems）進(jìn)行。18S或β-actin作為內(nèi)參。
13 DNase I消化測定
分離細(xì)胞核并裂解用于DNase I消化測定。在37℃下消化5分鐘后，提取total DNA以進(jìn)行qPCR，用如上所述的TCF7啟動子特異性引物進(jìn)行測定。
14 腫瘤增殖細(xì)胞（TPCs）相對頻率分析
使用極端有限稀釋法(ELDA) 來估計(jì)TPC的相對頻率（ELDA）軟件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）?？ǚ綑z驗(yàn)獲得統(tǒng)計(jì)p值。
15 Northern Blot分析
按照Wang et al., 2013b方法提取肝癌干細(xì)胞和對照細(xì)胞的total RNA，進(jìn)行Northern Blot分析。lncTCF7 特異性的DNA序列(nt320–683) 克隆入pcDNA4/mychis B 載體。使用CTP (Perkin Elmer)和Riboprobe體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記系統(tǒng)產(chǎn)生363nt放射性RNA探針。
16 RNA-FISH
熒光標(biāo)記的lncTCF7探針用于RNA-FISH。使用DNA probe sets進(jìn)行探針雜交。FV1000共聚焦顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞。
17 RNA Pull-down 和質(zhì)譜分析
按照Klattenhoff et al., 2013 報(bào)道的方法進(jìn)行RNA Pull-down。生物素標(biāo)記試劑盒，T7 RNA polymerase，DNase I ，產(chǎn)生生物素標(biāo)記的RNA（lncTCF7，他的反義RNA，及來源于lncTCF7內(nèi)含子區(qū)的兩個對照），RNeasy Mini Kit純化。肝癌干細(xì)胞細(xì)胞核提取，與生物素標(biāo)記的RNA孵育，pulldown蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，質(zhì)譜分析。
18 RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)
LightShift Chemiluminescent RNA EMSA Kit進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。上調(diào)的信號以BAF170的表達(dá)量為參照，使用GraphPad Prism 6繪Figure 。
19 統(tǒng)計(jì)分析
SPSS 13.0，GraphPad Prism 6 使用雙尾Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，致瘤頻率使用(ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)計(jì)算，p < 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
4 結(jié)果
1 肝CSCs lncTCF7高表達(dá)
雖然CD13和CD133已被廣泛用作肝CSC表面標(biāo)志物，HCC細(xì)胞系或HCC原發(fā)樣品中，單獨(dú)的CD133或CD13可以富集更多的細(xì)胞群（Figures S1A and S1B）。Haraguchi et al. (2010) 證明了部分CD13+ CD133+細(xì)胞與其對應(yīng)的CD13-CD133-相比表現(xiàn)出緩慢的生長。此外，相比CD13-CD133-細(xì)胞亞群，部分CD13 + CD133 +細(xì)胞對化學(xué)藥物治療具有高度抗性。值得注意的是，我們觀察到在9種HCC細(xì)胞系七種成功富集到CD13 + CD133 +細(xì)胞亞群，我們檢查了30個HCC原發(fā)樣品（Figure S1B），超過90％富集到CD13 + CD133 +細(xì)胞亞群。因此，我們結(jié)合CD13和CD133富集CD13 + CD133 +細(xì)胞，鑒定為肝CSCs，用于本研究。
然后我們對CD13 + CD133 +細(xì)胞進(jìn)行了分選，Hep3B，Huh7和PLC/PRF/5 HCC細(xì)胞系鑒定為肝CSCs。實(shí)際上，來源于Hep3B細(xì)胞CD13 + CD133 +亞群，相比CD13-CD133-細(xì)胞顯著增強(qiáng)的腫瘤成球形成（10.3％±1.3％對2.6％±0.3％; p =0.003）（Figure S1C）。另外，腫瘤球形成頻率來源于Hep3B細(xì)胞 CD13 + CD133 +和CD13 + CD133-亞群為10.3％±1.3％對6.1％±1.1％（p =0.0253）; CD13 + CD133 +與CD13-CD133 +相比分別為10.3％±1.3％對5.2％±1.3％（p = 0.0226）（Figure S1C）。Huh7和PLC/PRF/5 HCC細(xì)胞系獲得了類似的觀察結(jié)果（Figure S1C）。來自Hep3B細(xì)胞的CD13 + CD133 +亞群的成瘤能力細(xì)胞明顯高于單個CD13 +或CD133 +細(xì)胞亞群（Figure S1D和S1E）。Huh7細(xì)胞結(jié)果類似。我們得出結(jié)論，腫瘤的致瘤能力CD13 + CD133 +細(xì)胞亞群遠(yuǎn)高于單個CD13 +或CD13 +細(xì)胞亞群。值得注意的是，細(xì)胞周期分析（Figure S1F）發(fā)現(xiàn)CD13 + CD133 +細(xì)胞與CD13-CD133-細(xì)胞增殖能力沒有顯著差異。為了鑒定參與肝CSCs的lncRNA，我們對CD13 + CD133 +細(xì)胞（以下簡稱稱為肝CSCs）、CD13-CD133-細(xì)胞（non-CSCs）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。與non-CSCs相比，286個非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物在肝CSCs中異常表達(dá)（Figure 1A），我們隨機(jī)選擇10個差異lncRNAs在肝CSCss中進(jìn)行了驗(yàn)證（Figure S1G）。
由于lncRNA可以順式作用調(diào)節(jié)鄰近基因的表達(dá)或通過多種機(jī)制反式調(diào)節(jié)其他基因表達(dá)，我們專注于基因間lncRNAs，它們在肝CSCs中高表達(dá)并在干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子附近，這些干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子是蛋白編碼基因可以影響干細(xì)胞信號通路。在這些高表達(dá)的基因間lncRNAs中，我們專注于一個未鑒定的lncRNA，稱為lncTCF7（gene symbol TCONS_00009511-XLOC_004555）。 lncTCF7是肝CSCs中表達(dá)最高的lncRNA之一(Figure 1A and Figure S1G) 。位于5號染色體上，為熱休克70kDa蛋白4（HSPA4）和T細(xì)胞因子7（TCF7）之間。 lncTCF7由三個外顯子組成和跨越近3.6千堿基（kb），是中度保守的基因位點(diǎn)。我們進(jìn)一步證實(shí)了lncTCF7在肝CSCs中高度表達(dá)（Figure 1C），以及在源自HCC細(xì)胞系和HCC原發(fā)樣品的腫瘤成球細(xì)胞中表達(dá)（Figure 1D和1E）。我們接下來檢查了一組37對配對HCC腫瘤和腫瘤周圍組織，以及14種乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝硬化組織和8個正常肝組織（table S1）。我們觀察到lncTCF7在HCC腫瘤（Figure 1F和Figure S1H）和HCC細(xì)胞中顯著高表達(dá)（Figure S1I）。而肝硬化樣本和健康肝組織幾乎檢測不到（Figure 1F和Figure S1H）。此外，lncTCF7在其他一些原發(fā)組織無法檢測到（Figure S1J），提示lncTCF7有嚴(yán)格限制的表達(dá)模式。
我們進(jìn)一步通過northern印跡檢查了肝CSCs中l(wèi)ncTCF7的轉(zhuǎn)錄本。肝CSCs中只有一種lncTCF7的轉(zhuǎn)錄變體，長度在500到1,000個堿基之間（Figure 1G）。然而，non-CSCs中l(wèi)ncTCF7表達(dá)低得多。RACE測定lncTCF7轉(zhuǎn)錄物cDNA（Figure S1K）總長度為683nt的，沒有顯示編碼潛力（Figure S1L和S1M）。此外，通過RNA熒光原位雜交（RNA FISH）和細(xì)胞組分分析（Figure 1H和1I）lncTCF7定位于HCC腫瘤的細(xì)胞核中。lncTCF7在腫瘤成球細(xì)胞中高表達(dá)，在非成球細(xì)胞中表達(dá)很差。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7，作為lncRNA，在HCC腫瘤組織和肝CSCs中高度表達(dá)。
2 lncTCF7是肝CSCs自我更新維持所必需的。
為了確定lncTCF7在肝CSCs自我更新中的作用，我們使用慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA（shRNAs）將肝CSCs中l(wèi)ncTCF7外顯子1或3（Figure 2A）沉默。shRNA-2（針對外顯子3）獲得更高的敲低效率。值得注意的是，與對照（shCtrl）細(xì)胞比較，lncTCF7敲低顯著降低了多能轉(zhuǎn)錄因子Sox2，Nanog，Oct4的表達(dá)（Figure 2B）。相反，lncTCF7敲低不影響cMyc表達(dá)。實(shí)際上，c-Myc在lncTCF7沉默和shCtrl中均高表達(dá)，其表達(dá)在loss-of-function實(shí)驗(yàn)中沒有顯著改變（Figure 2B）。另外，lncTCF7敲低顯著減少了CD13 + CD133 +細(xì)胞（CSC）部分的產(chǎn)生（Figure 2C）。重要的是，lncTCF7敲低顯著降低了HCC細(xì)胞系和HCC原代細(xì)胞的初級，第二和第三瘤球形成（Figure 2D）。
lncTCF7沉默也減弱了初級成瘤細(xì)胞的第二和第三次瘤形成。在lncTCF7沉默的PLC/PRF/5細(xì)胞中獲得了類似的觀察結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，HCC原發(fā)性腫瘤細(xì)胞中的lncTCF7敲低顯著降低了Sox2和Nanog的表達(dá)（Figure 2E）。更重要的是，我們對源自HCC細(xì)胞系和原代樣品的CD13 + CD133 +細(xì)胞亞群進(jìn)行了第2代和第3代異種移植腫瘤生長實(shí)驗(yàn)。我們注意到來自第2代和第3代的CD13 + CD133 +細(xì)胞群顯示出更強(qiáng)的腫瘤起始能力（Figure S2A）和腫瘤球形成能力（Figure S2B），表明CD13 + CD133 +細(xì)胞群的長期自我更新能力。此外，與non-CSC相比，肝CSCs中的Ki67信號沒有明顯改變（Figure S2C）。然而，在肝CSCs中Sox2的量顯著增加，但在non-CSC中則沒有。相比之下，與空載體處理的細(xì)胞相比，lncTCF7過表達(dá)顯著增強(qiáng)肝CSCs中的Sox2信號，而過表達(dá)lncTCF7的CSCs中Ki67信號沒有改變。在異種移植腫瘤中獲得了類似的觀察結(jié)果（Figure S2E），表明lncTCF7介導(dǎo)的肝癌致瘤性主要由CSCs的自我更新能力引起。
我們接下來探討了lncTCF7在腫瘤起始形成中的作用。我們使用穩(wěn)定敲低了lncTCF7和shCtrl細(xì)胞皮下注射BALB/c裸鼠。通過有限稀釋異種移植（limiting dilution xenograft analysis）分析與shCtrl原發(fā)性腫瘤細(xì)胞相比較，lncTCF7敲低導(dǎo)致腫瘤存在更弱（Figure 2F），表明lncTCF7敲低降低了腫瘤起始形成能力。此外，lncTCF7敲低顯著抑制異種移植腫瘤生長和致瘤細(xì)胞頻率（Figure 2G和2H）。我們觀察了4個月的異種移植生長，并確定腫瘤可檢測性的閾值腫瘤大小為30-40立方毫米。 在lncTCF7沉默的HCC細(xì)胞系中觀察到了類似的結(jié)果（Figure S2F-S2H）。 總之，lncTCF7沉默減弱了肝CSCss的致瘤能力。
3 lncTCF7過表達(dá)增強(qiáng)肝CSCs的致瘤能力
我們接下來在HCC原發(fā)性腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞系中過表達(dá)lncTCF7，并建立lncTCF7穩(wěn)定過表達(dá)的細(xì)胞系（Figure 3A和Figure S3A）。lncTCF7過表達(dá)顯著增加多能轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)（Figure 3B）。值得注意的是，lncTCF7過表達(dá)顯著增強(qiáng)了瘤成球和腫瘤起始形成能力（Figure 3C和3D）。同樣，lncTCF7過表達(dá)顯著增加了異種移植腫瘤生長（Figure 3E）和致瘤細(xì)胞頻率（Figure 3F）。我們至少檢測了6個HCC初級樣品均獲得類似的觀察結(jié)果。在lncTCF7過表達(dá)的HCC細(xì)胞系如Hep3B和Huh7細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果（Figure S3）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7在肝CSCs的自我更新維持中起關(guān)鍵作用。
4 lncTCF7促進(jìn)TCF7表達(dá)激活Wnt信號
為了探索lncTCF7的靶基因，我們建立了lncTCF7沉默的HCC原代CSC細(xì)胞并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組微陣列分析。lncTCF7敲低導(dǎo)致2,491個基因的差異表達(dá)（Figure S4A），表明lncTCF7調(diào)節(jié)許多與重要信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的基因，包括Wnt信號傳導(dǎo)途徑（Figure S4B）。顯然，lncTCF7敲低顯著降低了其附近的蛋白質(zhì)編碼基因TCF7和一些主要的Wnt信號靶標(biāo)（Figure 4A）。相比之下，HSPA4和其他相鄰基因沒有顯示出顯著變化。然后，我們在HCC細(xì)胞系（Hep3B，Huh7和PLC）或HCC原代細(xì)胞（至少六個樣品）中驗(yàn)證了這些結(jié)果。一致地，lncTCF7沉默顯著降低了TCF7和主要Wnt靶標(biāo)的表達(dá)（Figure 4B和4C以及Figure S4C和S4D）。相比之下，lncTCF7敲除不改變HSPA4和其他相鄰基因的表達(dá)（Figure S4C和S4E）。此外，HCC細(xì)胞系或HCC原代細(xì)胞中的lncTCF7過表達(dá)顯著增強(qiáng)了TCF7和主要Wnt靶標(biāo)的表達(dá)（Figure S4F）。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7激活HCC中的Wnt信號傳導(dǎo)途徑。
我們通過定量實(shí)時PCR進(jìn)一步檢測了HCC受試者中l(wèi)ncTCF7和TCF7的表達(dá)水平。我們注意到lncTCF7表達(dá)與TCF7的表達(dá)正相關(guān)（Pearson相關(guān)系數(shù)r = 0.693，p <0.001）（Figure 4D）。為了確定lncTCF7在肝CSCs自我更新的調(diào)節(jié)中是否在TCF7的上游起作用，我們在lncTCF7沉默的HCC細(xì)胞中高表達(dá)TCF7（Figure 4E）。有趣的是，TCF7恢復(fù)挽救了由lncTCF7敲除減少的瘤形成能力（Figure 4F）。此外，TCF7恢復(fù)還挽救了lncTCF7敲低減少的腫瘤起始能力和異種移植腫瘤生長（數(shù)據(jù)未顯示）。 lncTCF7沉默顯著下調(diào)一些主要Wnt分子的表達(dá)，包括Wnt7a，Wnt4和Wnt2b（Figure 4A和4B）。在這三種Wnt分子中，lncTCF7敲低降低最多的是Wnt7a的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Wnt7a是否是lncTCF7的下游效應(yīng)子，我們將lncTCF7沉默的HCC原發(fā)CSCs與重組Wnt7a一起孵育用于瘤球形成測定。我們發(fā)現(xiàn)Wnt7a恢復(fù)了由lncTCF7消耗減少的瘤球形成能力（Figure S4G）。另外，Wnt7a還恢復(fù)了lncTCF7敲低的HCC原代CSC中TCF7，Sox2和Nanog的表達(dá)水平（Figure S4H）。據(jù)報(bào)道，DKK1（Dickkopf相關(guān)蛋白1）是Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞外抑制劑。DKK1的存在能夠消除由lncTCF7過表達(dá)引起的瘤球形成能力（Figure S4I）。一致地，DKK1處理還阻礙了過表達(dá)lncTCF7的HCC初級CSC細(xì)胞中TCF7，Sox2和Nanog的表達(dá)水平（Figure S4J）。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7促進(jìn)TCF7表達(dá)維持肝CSCs的自我更新。
為了進(jìn)一步探討TCF7在HCC中的臨床意義，我們分析了TCF7在HCC腫瘤和腫瘤周圍組織中的表達(dá)。我們觀察到TCF7在HCC腫瘤中高度表達(dá)（Figure 4G）。另外，TCF7主要定位于HCC瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，而在非瘤球細(xì)胞中幾乎檢測不到（Figure 4H）。通過免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步證實(shí)了HCC樣品中TCF7的高表達(dá)（Figure 4I）。重要的是，TCF7的高表達(dá)病人的5年生存率較低（Figure 4J）。接下來，我們在HCC細(xì)胞中沉默TCF7并建立穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系（Figure 4K）。值得注意的是，TCF7敲低抑制了Sox2的表達(dá)。我們觀察到TCF7沉默顯著減少了HCC細(xì)胞系和原代細(xì)胞中的球囊形成，腫瘤起始能力和異種移植生長（Figure 4L-4N，和數(shù)據(jù)未顯示）。總之，lncTCF7啟動TCF7表達(dá)以激活Wnt信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致肝CSCs自我更新和腫瘤傳播的引發(fā)。
5 lncTCF7招募SWI/SNF綜合體
lncRNA可以通過RNA相互作用蛋白發(fā)揮其功能，通過各種機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)（Geisler和Coller，2013）。因此，我們用生物素標(biāo)記的lncTCF7進(jìn)行RNA pull-down測定，以尋找潛在的lncTCF7相關(guān)蛋白。鑒定了SWI/SNF復(fù)合物的三個核心亞基BRG1，BAF170和SNF5在肝CSCs中結(jié)合lncTCF7（Figure 5A和5B以及Figure S5A-S5C）。通過RNA免疫沉淀（RIP）進(jìn)一步驗(yàn)證了lncTCF7與三種SWI/SNF組分的相互作用（Figure 5C和Figure S5D）。然而，lncTCF7敲低不影響B(tài)AF170，BRG1和SNF5的表達(dá)水平（Figure 5D），表明lncTCF7不參與SWI/SNF復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄后后調(diào)節(jié)。此外，lncTCF7在HCC瘤球細(xì)胞的細(xì)胞核中與BAF170共定位，而lncTCF7在非瘤球細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)很少（Figure 5E）。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7與肝CSCs細(xì)胞核中的SWI/SNF復(fù)合物相關(guān)。我們接下來構(gòu)建了一系列l(wèi)ncTCF7片段，以將其結(jié)合片段與SWI/SNF復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合。我們發(fā)現(xiàn)lncTCF7的3’端片段（nt 468至683）高效結(jié)合BAF170，BRG1和SNF5（Figure 5F）。通過RNA折疊分析預(yù)測3’端片段的穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)（Figure S5E）。通過RNA電遷移率變動分析（EMSA）進(jìn)一步證實(shí)了lncTCF7的3’末端區(qū)域與BAF170的結(jié)合（Figure 5G和5H）。未標(biāo)記的lncTCF7探針競爭性地破壞了這種結(jié)合能力。另外，lncTCF7顯示高結(jié)合親和力（解離常數(shù)[Kd] 36.24nM）（Figure 5I）。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7以高親和力直接結(jié)合SWI/SNF復(fù)合物。
6 lncTCF7促進(jìn)TCF7表達(dá)以激活Wnt信號
鑒于SWI/SNF復(fù)合物通過與基因啟動子結(jié)合并重折疊染色質(zhì)來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，然后我們檢測lncTCF7是否影響TCF7基因啟動子與BAF170結(jié)合。我們分析了TCF7基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）上游的3kb基因座。我們發(fā)現(xiàn)lncTCF7敲除減少了BAF170與（大約）~1,160至~1048bp的TCF7啟動子區(qū)段的結(jié)合能力（Figure 6A），表明該區(qū)段是lncTCF7的結(jié)合位點(diǎn)。通過熒光素酶報(bào)告分析，我們鑒定到（大約）1,200至約1,100bp的TCF7啟動子區(qū)段作為BAF170的高效結(jié)合位點(diǎn)（Figure 6B-6D）。最后，我們通過DNA酶I消化測定法觀察到lncTCF7或BAF170敲低顯著減弱了TCF7基因座的染色質(zhì)可塑性（Figure 4E）。相比之下，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析（Figure S6A-S6D）評估，BAF170未能在干細(xì)胞多能因子的啟動子上募集，表明BAF170對干細(xì)胞多能因子的表達(dá)是間接作用。這些數(shù)據(jù)表明lncTCF7募集SWI/SNF復(fù)合物到TCF7啟動子，從而導(dǎo)致其活化。
值得注意的是，SWI/SNF復(fù)合物在HCC腫瘤和肝CSCs中高度表達(dá)（Figure 6F和數(shù)據(jù)未顯示），表明SWI/SNF復(fù)合物可能涉及肝CSCs自我更新的調(diào)節(jié)。因此，BAF170敲低顯著降低了TCF7和Nanog（Figure 6G）以及Wnt下游靶標(biāo)（例如Sox2，CCND1和CCND2）的表達(dá)。此外，BAF170敲低顯著減弱了HCC細(xì)胞系和HCC原代細(xì)胞的瘤形成能力（Figure 6H）。最后，BAF170敲低還顯著降低了腫瘤起始能力和異種移植腫瘤生長（Figure 6I-6K）。通過敲低SNF5和BRG1觀察到類似的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）?？傊?，我們的數(shù)據(jù)顯示lncTCF7通過募集SWI/SNF復(fù)合物促進(jìn)TCF7表達(dá)，啟動肝CSCs的自我更新和腫瘤起始。
5 討論
最近，已經(jīng)在許多實(shí)體瘤中鑒定出CSCs，包括乳腺癌，肺癌，肝癌，腦癌，結(jié)腸癌，前列腺癌和膀胱癌。CSCs具有干細(xì)胞特征，例如自我更新和分化。由于其侵入性和耐藥性，CSCs可以解釋癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。已經(jīng)在肝CSCs中鑒定了幾種表面標(biāo)志物。然而，肝CSCs生物學(xué)的細(xì)節(jié)仍然很大程度上未知。在該研究中，我們從HCC細(xì)胞系和HCC原代細(xì)胞中分離了CD13 + CD133 +細(xì)胞亞群，并將它們鑒定為肝CSC。通過轉(zhuǎn)錄組微陣列分析，我們在肝CSCs中鑒定了286個差異表達(dá)的非編碼RNA。在這些高表達(dá)的肝CSCs中的lncRNA中，我們定義了一種稱為lncTCF7的lncRNA，其在引發(fā)肝CSCs的自我更新中起關(guān)鍵作用。
據(jù)報(bào)道，lncRNA在基因調(diào)控和其他細(xì)胞過程中發(fā)揮著廣泛的作用。lncRNA通過多種機(jī)制發(fā)揮其功能，包括共轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，參與核或細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物，以及與其他RNA的配對。值得注意的是，許多證據(jù)表明lncRNA作為表觀遺傳修飾物調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在這里，我們發(fā)現(xiàn)lncTCF7通過募集SWI/SNF復(fù)合物順式激活TCF7表達(dá)。TCF7表達(dá)促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)以啟動肝CSCs的自我更新。盡管lncTCF7以反義方向表達(dá)，但它不能形成用于調(diào)節(jié)TCF7表達(dá)的lncTCF7-TCF7 mRNA復(fù)合物。Wnt信號在CSCs的自我更新和分化中起關(guān)鍵作用。Wnt信號傳導(dǎo)的異常激活與肝癌和其他慢性肝病有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示TCF7和Wnt下游靶基因下調(diào)減弱肝CSCs的自我更新及其腫瘤起始能力，表明TCF7介導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)對于維持肝CSCs自我更新和致瘤性是至關(guān)重要的。
CSCs具有自我更新和分化的干細(xì)胞特性。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)通過細(xì)胞周期分析和免疫熒光染色分析，肝CSCs和non-CSC之間的增殖能力沒有顯著差異。實(shí)際上，CSCs主要存在于具有休眠或緩慢生長特性的G1/G0期或G0期。因此，可能難以通過Ki67染色或通過碘化丙啶（PI）測定的DNA含量來區(qū)分肝CSCs和non-CSCs之間的增殖差異。而且，不同癌癥類型的自我更新特性可具有不同的增殖特征。維持自我更新是一個極其復(fù)雜的生物過程，由表觀遺傳狀態(tài)，多能轉(zhuǎn)錄因子，表觀遺傳復(fù)合物和許多發(fā)育通路調(diào)控。我們的數(shù)據(jù)支持這樣的觀點(diǎn)，即肝CSCs中l(wèi)ncTCF7介導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)激活在肝CSCs自我更新的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。
TCF7作為T細(xì)胞因子，以其在T淋巴細(xì)胞發(fā)育和多能造血細(xì)胞自我更新中的功能而聞名。TCF7可以啟動Wnt信號作為上游觸發(fā)器。TCF7-/-小鼠發(fā)生腸和乳腺腺瘤，暗示TCF7在腫瘤抑制中的作用。在本研究中，我們證明TCF7是肝CSCs自我更新和腫瘤增殖所必需的，并且充當(dāng)腫瘤啟動子。TCF7受肝CSCs中的lncTCF7調(diào)節(jié)，以激活Wnt信號通路，從而引發(fā)肝CSCs的自我更新。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，TCF7在胚胎干細(xì)胞衍生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的眼移植后作為腫瘤發(fā)生的腫瘤增強(qiáng)劑發(fā)揮作用?？偟膩碚f，我們的研究結(jié)果揭示了lncTCF7介導(dǎo)的TCF7表達(dá)，啟動了Wnt信號傳導(dǎo)。促進(jìn)肝CSCs的自我更新和作為肝腫瘤啟動子增強(qiáng)致瘤性。 CSCs類似于組織特異性干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈冇兄陂L期生長并且負(fù)責(zé)腫瘤的維持和生長。轉(zhuǎn)錄調(diào)控是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制之一，其中包括順式調(diào)控元件和反式作用因子。在所有反式因子中，染色質(zhì)重塑調(diào)控在基因轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，并依賴于ATP-依賴的染色質(zhì)重塑復(fù)合物。SWI/SNF復(fù)合物由12-15個亞基組成，其中含有兩個催化ATP酶亞基之一，SMARCA4/BRG1或SMARCA2/ BRM，以及幾個核心成分，如SMARCB1/SNF5，BAF170和BAF155 。SWI/SN復(fù)合物通過動員核小體調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并利用ATP水解的能量重塑染色質(zhì)，表明其在基因表達(dá)中的關(guān)鍵作用。幾種SWI/SNF亞基中的失活突變引起各種人類癌癥，表明一些組分充當(dāng)腫瘤抑制劑。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，長非編碼RNA SChLAP1與SNF5亞基結(jié)合，通過拮抗SWI/SNF復(fù)合物的功能來促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展，這意味著SNF5起腫瘤抑制劑的作用。在這里，我們發(fā)現(xiàn)lncTCF7可以募集SWI/SNF復(fù)合物以啟動TCF7表達(dá)，從而引發(fā)肝CSCs自我更新。此外，我們觀察到BAF170，BRG1和SNF5在HCC標(biāo)本和肝CSCs中高度表達(dá)，其敲低減弱腫瘤起始能力和腫瘤增殖（Figure 6，數(shù)據(jù)未顯示），表明這三種成分充當(dāng)腫瘤促進(jìn)劑。因此，SWI/SNF復(fù)合物組分如何在腫瘤發(fā)生中起作用仍有待進(jìn)一步研究。
總之，lncTCF7可通過將SWI/SNF復(fù)合物募集到TCF7啟動子，通過激活Wnt信號傳導(dǎo)來促進(jìn)肝CSCs自我更新和腫瘤增殖。我們的研究結(jié)果表明，lncRNA可以作為腫瘤發(fā)生的另一種調(diào)節(jié)分子。
微信掃描二維碼關(guān)注公眾號回復(fù)數(shù)字 “180741” 下載文獻(xiàn)原文
其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀
文獻(xiàn)解讀：Twist1通過環(huán)狀RNA circ-10720調(diào)控Vimentin（波形蛋白）進(jìn)而促進(jìn)肝癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換
文獻(xiàn)解讀：肝缺血/再灌注損傷模型circRNAs表達(dá)譜分析
文獻(xiàn)解讀：RNAseq研究嬰兒血管瘤circRNAs表達(dá)譜 circRNAseq + qpcr驗(yàn)證
文獻(xiàn)解讀：人胎兒腦發(fā)育過程中circRNAs表達(dá)譜變化（純數(shù)據(jù)分析）
文獻(xiàn)解讀：circRNA-seq 數(shù)據(jù)分析 + qPCR驗(yàn)證 -- 蟾蜍睪丸組織
文獻(xiàn)解讀：circRNA-seq 數(shù)據(jù)分析 + qPCR驗(yàn)證 -- 人喉鱗狀細(xì)胞癌
文獻(xiàn)解讀：rRNA去除RNAseq (mRNA, lncRNA, circRNA)數(shù)據(jù)分析 + Sanger驗(yàn)證 -- 人肺腺癌
