Twist1 regulates Vimentin through Cul2 circular RNA to promote EMT in hepatocellular carcinoma

Twist1通過環(huán)狀RNA circ-10720調(diào)控Vimentin（波形蛋白）進(jìn)而促進(jìn)肝癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換

期刊：Cancer?Research；影響因子：9.13

發(fā)表單位：南開大學(xué)

1 摘要

    Twist1是epithelial-mesenchymal transition (EMT，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化)過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以提高Vimentin（波形蛋白）的表達(dá)，但其中的機(jī)制并不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)Twist1可以調(diào)控環(huán)狀RNA Cullin2 (Cul2) 進(jìn)而提高EMT過程中Vimentin的表達(dá)。Twist1可以結(jié)合到基因Cul2的啟動(dòng)子區(qū)，選擇性的激活Cul2的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本(circ-10720) 而非mRNA。circ-10720與Twist1的表達(dá)，肝細(xì)胞癌惡化程度、不良預(yù)后呈正相關(guān)。Twist1可以通過提高circ-10720的表達(dá)水平促進(jìn)Vimentin的表達(dá)，circ-10720可以海綿吸附調(diào)控Vimentin的microRNA。體外實(shí)驗(yàn)，異種移植小鼠模型中敲低circ-10720可以減弱Twist1促進(jìn)腫瘤發(fā)展的能力。數(shù)據(jù)揭示了EMT過程中Twist1調(diào)控Vimentin的機(jī)制，為肝癌治療提供了新的靶點(diǎn)，為研究基于circRNA的診斷和治療提供了新的角度。

2 研究背景

    Epithelial-mesenchymal transition (EMT) 是腫瘤轉(zhuǎn)移所必須的，涉及到細(xì)胞重編程過程，上皮細(xì)胞改變其形狀，提高運(yùn)動(dòng)能力并獲得間質(zhì)細(xì)胞表型。Twist1是EMT過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過靶基因啟動(dòng)子的激活或抑制控制EMT相關(guān)基因，上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞表型相關(guān)的基因如Vimentin。Vimentin是一個(gè)3型中間絲蛋白，是EMT間質(zhì)細(xì)胞marker。Vimentin可以驅(qū)動(dòng)細(xì)胞柔軟性，與不良預(yù)后和高頻轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前，一些重要的cis元件和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子與Vimentin的表達(dá)相關(guān)。比如Sp1/Sp3結(jié)合GC-Box 1，Stat1/Stat3結(jié)合ASE，c-Jun可以與AP-1家族形成homo- or heterodimers結(jié)合到AP-1位點(diǎn)，所有這些都可以增加Vimentin的轉(zhuǎn)錄。另外，磷酸化的Slug不能直接結(jié)合到Vimentin啟動(dòng)子區(qū)，可以調(diào)控其他的轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)Vimentin表達(dá)。證據(jù)表明EMT過程中Twist1可以上調(diào)Vimentin表達(dá)，但機(jī)制并不清楚，也沒有明顯的證據(jù)說明Twist1可以結(jié)合到Vimentin啟動(dòng)子區(qū)。

    Cullin2 (Cul2) 是multiple ECS (ElonginB/C-CUL2/5-SOCS-box protein) E3泛素蛋白連接酶復(fù)合物核心成分之一，可介導(dǎo)多個(gè)蛋白泛素化。預(yù)測Cul2是個(gè)腫瘤抑制蛋白，可以降解泛素化HIFα 。然而，有報(bào)道稱Cul2是正常血管生成中所需要的，并與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。近些年認(rèn)為circRNAs是轉(zhuǎn)錄后水平基因調(diào)控的重要分子。circRNAs來源于非常規(guī)的可變剪接，某外顯子的供體連接點(diǎn)與上游外顯子受體連接。證據(jù)顯示一些circRNAs可以發(fā)揮調(diào)控miRNAs的功能。有報(bào)道顯示circRNAs可以與線性RNA競爭剪接進(jìn)而調(diào)控基因表達(dá)。然而Cul2及其circRNAs在腫瘤發(fā)展中的作用并不清楚。

    本研究，我們發(fā)現(xiàn)Twist1通過結(jié)合Cul2啟動(dòng)子上調(diào)Cul2 circRNAs表達(dá)，抑制Cul2 mRNA表達(dá)促進(jìn)Cul2轉(zhuǎn)錄。我們發(fā)現(xiàn)circ-10720與Twist1表達(dá)正相關(guān)并促進(jìn)EMT過程。circ-10720通過吸附靶向Vimentin 的miRNAs上調(diào)Vimentin的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)敲低circ-10720會(huì)阻礙Twist1對(duì)Vimentin的正調(diào)控。本研究描述了一個(gè)新的Twist1-circRNA-Vimentin調(diào)控機(jī)制，并提供間質(zhì)腫瘤新的潛在的治療靶點(diǎn)。

3 材料方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

    PLC-PRF-5和SMMC-7721細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)，HEK-293T細(xì)胞在Dulbecco’s modified Eagle’s培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并添加10% (v/v)胎牛血清，37 °C，5% CO2，濕潤空氣中培養(yǎng)。PLC-PRF-5, SMMC-7721 和 HEK-293T解凍后分別傳代約35, 42和24。細(xì)胞均經(jīng)過肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)，分子標(biāo)志物，生長曲線鑒定，及支原體檢測。質(zhì)粒信息在Supplementary Table S1中。circ-10720 siRNA引物在Supplementary Table S2 中。合成siRNA, miRNA和突變的miRNAs。Lipofectamine 2000或nanoparticle轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和miRNA。circ-10720慢病毒載體pLCDH-ciR及輔助載體psPAX2, pMD2.G轉(zhuǎn)入HEK-293T細(xì)胞。48h后收集病毒上清，超速離心進(jìn)行過濾和濃縮。

2 qRT-PCR

    TRIzol提取total RNA，Quantscript RT試劑盒使用Oligo(dT), random或miRNA-specific stem-loop primers合成cDNA。SYBR RT-PCR kit進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量。2-ΔΔCT計(jì)算表達(dá)水平，U6或β-actin作為內(nèi)參。引物列表在Supplementary Table S3。

3 雙熒光素酶基因檢測報(bào)告基因檢測

    重組雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒包含Cul2 啟動(dòng)子(pEZX-PG04-Cul2) ，Vimentin 3’-UTR (psiCHEK-2-Vimentin-3’UTR) 潛在miRNA結(jié)合位點(diǎn)，和circ-10720 (psiCHEK-2-circ-10720) 。Cul2啟動(dòng)子和Twist1過表達(dá)或敲低載體分別轉(zhuǎn)入到PLC-PRF-5和 SMMC-7721細(xì)胞中。48h后，雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測熒光素酶和分泌型堿性磷酸酶。Vimentin 3’-UTR，circ-10720熒光素酶報(bào)告載體and miRNA mimics轉(zhuǎn)入到HEK293T細(xì)胞中。海腎螢光素酶作為對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率校正。48h后試劑盒檢測熒光素酶活性。

4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

    使用24孔侵襲板進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48h后，PLC-PFR-5 and SMMC-7721細(xì)胞胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移到Matrigel基質(zhì)膠包被的上層小室中，小室含有100ul無血清培養(yǎng)基。FBS加入到下層小室作為引誘物。24h后，下層小室細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定，而后使用0.1%結(jié)晶紫染色。對(duì)下層小室表面的細(xì)胞隨機(jī)選取5處進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

    轉(zhuǎn)染24h后，用微量吸管對(duì)小室劃線。通過測量細(xì)胞運(yùn)動(dòng)到劃線區(qū)的數(shù)量評(píng)估細(xì)胞遷移能力。

6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

    PLC-PRF-5 and SMMC-7721細(xì)胞使用含3.7%福爾馬林的PBS室溫固定5分鐘，而后1%牛血清白蛋白封閉30分鐘，Vimentin抗體，Ecadherin抗體4℃孵育過夜，而后FITC- and TRITC-labeled的二抗室溫孵育1h。每一步都進(jìn)行2次5min PBS清洗。而后DAPI復(fù)染2分鐘，顯微鏡觀察。

7 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)

    1 × 107 SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞1%福爾馬林交聯(lián)10分鐘，0.25 M甘氨酸終止交聯(lián)并用冷PBS沖洗。細(xì)胞團(tuán)重新懸浮到1ml含有1×蛋白酶 Inhibitor Cocktail II細(xì)胞裂解液中，冰上孵育15分鐘，吸管吹打，800 × g 4℃離心5分鐘。細(xì)胞團(tuán)懸浮于1ml核裂解液中。超聲波破碎染色質(zhì)，并用Bioanalyzer評(píng)估。將部分染色質(zhì)與anti-Twist1單克隆抗體孵育4℃過夜。將protein/DNA復(fù)合物解交聯(lián)獲得游離DNA。微型離心柱純化，DNA片段高通量測序。

8 Western blotting實(shí)驗(yàn)

    PBS沖洗細(xì)胞，含protease Inhibitor Cocktail預(yù)冷裂解液冰上裂解細(xì)胞30分鐘。電泳分離裂解液并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，Cullin2、Twist1、Vimentin、GAPDH等抗體封閉，并4℃過夜，而后HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG secondary antibody室溫孵育1h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光基質(zhì)評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)。

9 人源腫瘤異種移植模型（PDTX model）

    收集手術(shù)切除的新鮮肝腫瘤組織。遵從Helsinki聲明，研究得到了倫理委員會(huì)的支持，包括使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和腫瘤樣品，并得到病人知情同意。病人信息如Supplementary Table S4。依據(jù)qPCR定量選擇8個(gè)Twist1低表達(dá)組織和8個(gè)Twist1高表達(dá)組織，而后將腫瘤分為兩組(Twist1-Low group, Twist1-High group) ，并切成1–2 mm3 小塊，置入含抗生素的RPMI培養(yǎng)基中。將腫瘤小塊移植到免疫缺陷小鼠的下背皮區(qū)。腫瘤長到100 – 200 mm3時(shí)，樣品體內(nèi)傳代構(gòu)建F2腫瘤，而后同理構(gòu)建F3代。當(dāng)F3腫瘤長到100 – 200 mm3，1×107 TU含有circ-10720慢病毒的載體HBSS注射到Twist1低表達(dá)組(Twist1-Low+circ-10720 groups) ，(Twist1-Low+control group) 作為對(duì)照。10OD circ-10720 siRNA 注入到Twist1-High組(Twist1-High+circ-10720 siRNA groups) ，control siRNA (Twist1-High+control siRNA group) 作為對(duì)照。每組4只，三天注射一次，處理18天。ELISAs檢測血清 α-fetoprotein (AFP) 表達(dá)量。數(shù)字卡尺每三天測量一次腫瘤直徑，V= (L × W2)/2 公式計(jì)算腫瘤體積。第24天殺掉小鼠收集腫瘤組織，10%福爾馬林固定并石蠟包埋。剩余組織-80℃凍存用于RNA提取。

10 二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的TetOn-Twist1小鼠肝癌模型

    使用位點(diǎn)特異性的單拷貝整合策略構(gòu)建TetOn-Twist1小鼠。對(duì)14-15天小鼠注射DEN(20 mg/kg body weight) 引起腫瘤產(chǎn)生。兩周后，每兩周注射苯巴比妥類TCPOBOP(3 mg/kg body weight) ，共7次促進(jìn)小鼠腫瘤生長。而后，肝癌小鼠自由分成兩組。一組6個(gè)小鼠無偉霸霉素薄膜片水飼養(yǎng)（對(duì)照組），第二組12個(gè)小鼠有偉霸霉素薄膜片水飼養(yǎng)（Twist1組），7天的無偉霸霉素薄膜片治療后，Twist1組一半的小鼠靜脈注射si-circ-10720 (10OD) ，另一半注射對(duì)照siRNA。兩周后宰殺，取肝組織檢測腫瘤數(shù)量并10%福爾馬林固定石蠟包埋。

11 免疫組化

    二甲苯石蠟組織脫蠟，梯度降低的酒精水化 。然后3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性。微波抗原修復(fù)技術(shù)修復(fù)抗原。封閉后，1抗（Twist1、E-cadherin、Vimentin）孵育4℃過夜。陰性對(duì)照使用PBS代替1抗。隨后使用HRP-polymer anti-mouse/rabbit IHC kit連接二抗，室溫孵育1h。而后樣品使用二氨基聯(lián)苯處理，蘇木精染色，中性樹膠封片。通過密度(0=negative, 1=canary yellow, 2=claybank, 3=brown) 和陽性細(xì)胞比例得分(1=less than 25%, 2=25% to 50%, 3=51% to 75%, 4=more than 75%) 計(jì)算組化得分。

12 熒光原位雜交

    含381例肝癌組織芯片進(jìn)行免疫組化和熒光原位雜交。circ-10720, circ-31603, circ-12201, circ-21832, circ-20827, and circ-31230 的表達(dá)水平使用FAM標(biāo)記的核酸修飾的circRNA探針進(jìn)行原位雜交。共焦顯微鏡評(píng)估circ-10720染色及表達(dá)情況。原位雜交探針如Supplementary Table S5。

13 掃描電鏡

    細(xì)胞生長在爬升膜上，轉(zhuǎn)染circ-10720 or si circ-10720。48h后，細(xì)胞固定并用醋酸酯水化，而后梯度酒精脫水。包金后，細(xì)胞使用掃描電鏡觀察。

14 統(tǒng)計(jì)分析

    GraphPad Prism 6 and SPSS v. 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Student’s t-test, one-way ANOVA, Pearson’s correlation, chi-square, and Kaplan-Meier等計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P < 0.05認(rèn)為有意義。

4 結(jié)果

1 circ-10720的表達(dá)與肝癌病人轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)

    為了研究Twist1的調(diào)控功能，我們分析了Twist1全基因組上可能的靶標(biāo)。對(duì)SMMC-7721 細(xì)胞使用Twist1抗體基于染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）進(jìn)行深度測序（ChIP-seq）。我們分析了Twist1基因組特征，顯示Twist1在Cul2啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)，如Figure 1A和Figure S1A-C。SMMC-7721細(xì)胞特殊抗體的ChIP-PCR分析Twist1對(duì)Cul2啟動(dòng)子區(qū)的作用，驗(yàn)證了ChIP-seq結(jié)果（Figure 1B）。進(jìn)一步我們使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測了Twist1對(duì)Cul2啟動(dòng)子區(qū)的作用。結(jié)果顯示過表達(dá)Twist1可以增強(qiáng)Cul2啟動(dòng)子活性，下調(diào)Twist1減少Cul2啟動(dòng)子活性（Figure 1C）。

    為了分析肝癌組織中Cul2的表達(dá)譜及與肝癌惡化的關(guān)系，我們研究了75個(gè)肝癌樣品。盡管Twist1可以調(diào)控Cul2啟動(dòng)子活性，但在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的樣品中Cul2的表達(dá)沒有顯著差異(P=0.489) (Figure 1D) 。因此我們猜測是Cul2產(chǎn)生的環(huán)狀RNA在肝癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。我們預(yù)測了幾個(gè)circRNAs，并對(duì)7個(gè)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)circ-10720有顯著變化(P=0.011)(Figure 1E)。 因此，本研究我們主要研究circ-10720在肝癌發(fā)展中的表達(dá)和功能。circ-10720在381個(gè)肝癌腫瘤組織中臨床分期和病理分級(jí)中是呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。進(jìn)而，我們研究了circ-10720在不同肝癌腫瘤分組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在AFP-positive (AFP>400 ng/ml) and HBsAg+/HBeAb+/HBcAb+分組中上調(diào)。結(jié)果說明，circ-10720的表達(dá)與AFP (P=0.001) and hepatitis B markers (P=0.038) (Figure 1G) 相關(guān)。同時(shí)我們分析了circ-10720與其他因子如age, sex, smoking, drinking, carbohydrate antigen(CA-199, CA-125), enzymes 的關(guān)系。結(jié)果顯示沒有顯著聯(lián)系(Supplementary Figure S2A-C) ，總之，上調(diào)表達(dá)的circ-10720或與肝癌的侵襲有關(guān)。

    進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中circ-10720的表達(dá)水平與Twist1的表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.425, P=0.0001) (Figure 1H) 。同時(shí)我們也研究了生存時(shí)間與circ-10720、Twist1表達(dá)水平的關(guān)系，Kaplan-Meier生存曲線顯示，高表達(dá)circ-10720與不良預(yù)后有關(guān)(Figure 1I) 。高表達(dá)的circ-10720、Twist1會(huì)縮短生存時(shí)間，生存時(shí)間中值從32個(gè)月下降到28.5個(gè)月(Figure 1J) 。結(jié)果顯示Twist1與circ-10720的表達(dá)水平并不完全同步，Twist1或許可以通過調(diào)控其他蛋白或circRNAs影響肝癌病人生存時(shí)間。

2 Twist1調(diào)控circ-10720影響肝癌細(xì)胞癌進(jìn)展

    為了確定Twist1是如何調(diào)控circ-10720的，我們研究了Cul2基因的pre-mRNA，mRNA，circ-10720，引物設(shè)計(jì)圖如Figure 2A。Twist1過表達(dá)可以提高PLC細(xì)胞Cul2基因pre-mRNA的表達(dá)量，其敲低表達(dá)可以減少pre-mRNA的表達(dá)量(Figure 2B) 。而，Twist1過表達(dá)時(shí)Cul2基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào)，而敲低Twist1時(shí)Cul2基因mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)(Figure 2C, 2D) 。另外，我們確信內(nèi)源性的circ-10720是由Cul2基因產(chǎn)生的，Cul2位于10號(hào)染色體，circ-10720由第6-12個(gè)外顯子構(gòu)成(Figure 2E) ，circ-10720在過表達(dá)的Twist1 PLC細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，在敲低Twist1 SMMC-7721中下調(diào)表達(dá)。

    為了研究circ-10720的功能，我們針對(duì)反向剪接序列設(shè)計(jì)了siRNA(Figure 2G, left) 。我們發(fā)現(xiàn)siRNA只會(huì)下調(diào)環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄本，而不會(huì)影響線性形式(Figure 2G, right) 。SEM觀察circ-10720過表達(dá)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，細(xì)胞偽足增加而且細(xì)胞形態(tài)變成間葉細(xì)胞樣的，當(dāng)circ-10720敲低時(shí)，細(xì)胞變成上皮樣(Figure 2H) 。免疫熒光分析circ-10720過表達(dá)和敲低EMT markers。結(jié)果顯示circ-10720過表達(dá)時(shí)E-cadherin表達(dá)量下降，Vimentin表達(dá)量上升，在敲低的circ-10720時(shí)結(jié)果相反(Figure 2I) 。另外，發(fā)現(xiàn)circ-10720可以促進(jìn)PLC細(xì)胞增殖遷移和侵襲(Figure 2J, 2K) ?？傊?，Twist1可以促進(jìn)circ-10720表達(dá)，而circ-10720可以促進(jìn)癌進(jìn)展。

3 Twist1通過增加circ-10720的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)Vimentin的表達(dá)，circ-10720可以海綿吸附miRNA

    為了鑒定circ-10720結(jié)合的miRNA，我們使用CircInteractome數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA。27個(gè)miRNAs中有14個(gè)(miR-1246, miR-127-5p, miR-331-5p, miR-1200, miR-888, miR-587, miR-578, miR-656, miR-890, miR-490-5p, miR-1238, miR-548g, miR-513a-3p, and miR-521) 得分值超過90(Figure 3A) 。我們使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miRNAs與circ-10720的結(jié)合及位點(diǎn)突變時(shí)關(guān)系(Supplementary Figure S3A) ，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNAs在結(jié)合位點(diǎn)突變時(shí)并沒有影響熒光的強(qiáng)度(Figure 3B) 。結(jié)果說明，circ-10720可能作為miRNAs海綿吸附發(fā)揮作用。其中miR-1246, miR-578 and miR-490-5p 預(yù)測可以與Vimentin結(jié)合(Supplementary Figure S3B) 。另外，我們也分析了miRNAs在肝正常樣品和肝癌樣品中的表達(dá)量(Supplementary Figure S3C) 。miR-1246, miR-578 and miR-490-5p確實(shí)在肝癌中表達(dá)。miR-490-5p的表達(dá)量高于miR-1246, miR-578。熒光素酶報(bào)告基因分析miRNAs會(huì)抑制Vimentin 3′-UTR熒光素酶活性，而突變的miRNA模擬物沒有這個(gè)影響。miR-490-5p的抑制作用強(qiáng)于miR-1246, miR-578。因此，miR-490-5p可能是主要miRNA調(diào)控Vimentin的表達(dá)。

    為了驗(yàn)證circ-10720吸附可以調(diào)控Vimentin的miRNAs，我們對(duì)過表達(dá)的circ-10720細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)譜研究。并對(duì)差異基因進(jìn)行GSEA富集分析。GO富集分析差異基因涉及到的生物學(xué)過程，分子功能和細(xì)胞組分。如Figure S4A，過表達(dá)circ-10720影響的差異基因涉及到cancer, EMT and VEGF signaling pathways，并且cell adhesion related pathways相關(guān)通路下調(diào)。GO分析中，intracellular signal introduction, wound healing, growth factor activity (Supplementary Figure S4B) 等上調(diào)。上調(diào)基因如Supplementary Figure S4C。蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與基因表達(dá)譜的結(jié)果相似，GSEA分析(Supplementary Figure S5A) and GO analysis (Supplementary figure S5B) 。與ntracellular transport, cellular invadopodia-related proteins, multicellular organism growth, TGF-β receptor signaling pathways 等相關(guān)的上調(diào)基因如Supplementary Figure S5C。

    為了證明 Twist1介導(dǎo)Vimentin的調(diào)控是通過circRNA發(fā)生的，我們進(jìn)行l(wèi)oss-of-function實(shí)驗(yàn)。PLC細(xì)胞過表達(dá)時(shí)circ-10720的表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步敲低circ-10720抵消circ-10720的增長(Figure 3D) 。肝癌樣品中 Twist1與Vimentin的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，同時(shí)表達(dá)時(shí)病人更短的生存時(shí)間(Supplementary Figure S6A-B) 。Western blotting結(jié)果顯示Twist1可以提高Vimentin的表達(dá)水平，而過表達(dá)Twist1的PLC細(xì)胞，敲低circ-10720會(huì)影響Twist1對(duì)Vimentin的正調(diào)控表達(dá)(Figure 3E) 。免疫熒光分析過表達(dá)Twist1顯示E-cadherin表達(dá)量明顯下降而Vimentin的表達(dá)水平明顯上升，過表達(dá)Twist1細(xì)胞敲低circ-10720時(shí)會(huì)影響Twist1對(duì)E-cadherin和Vimentin表達(dá)調(diào)控。而且敲低circ-10720會(huì)抵消過表達(dá)Twist1引起的細(xì)胞增殖(Figure 3G) ，遷移(Figure 3H) ，和侵襲(Figure 3I)。上述結(jié)果顯示Twist1是通過circ-10720吸附miRNAs調(diào)控Vimentin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌進(jìn)展的。

4 肝癌PDTX模型瘤內(nèi)沉默circ-10720阻礙Twist1介導(dǎo)的Vimentin表達(dá)

    為了研究體內(nèi)Twist1通過circ-10720調(diào)控Vimentin表達(dá)及circ-10720體內(nèi)功能，我們建立了PDTX模型(Figure 4A) 。首先qPCR檢測肝癌病人腫瘤組織Twist1表達(dá)量，而后將組織分為兩組Twist1-Low and Twist-High組 (Figure 4B) ，Twist1-Low組一半瘤內(nèi)注射circ-10720慢病毒，Twist-High組一半瘤內(nèi)注射si-circ-10720。高表達(dá)的Twist可以顯著促進(jìn)腫瘤的生長。Twist-Low組過表達(dá)circ-10720可以增加腫瘤體積。而Twist-High組敲低circ-10720可以阻礙Twist促進(jìn)癌生長的功能(Figure 4C) 。qPCR檢測Twist1-Low+control, Twist1-Low+circ-10720, TwistHigh+siRNA control, and Twist-High+si-circ-10720 groups circ-10720的表達(dá)量。結(jié)果顯示circ-10720在Twist1-Low+circ-10720 and Twist-High+siRNA組表達(dá)量高。敲低circ-10720可以抵消Twist1-High促進(jìn)腫瘤的功能(Figure 4D) 。高表達(dá)Twist1可顯著增加Vimentin表達(dá)，而敲低circ-10720減少Twist1促進(jìn)Vimentin作用。過表達(dá)circ-10720可以增加Vimentin的表達(dá)。敲低Twist-High組circ-10720和過表達(dá)Twist1-Low組circ-10720對(duì)Twist1的表達(dá)水平影響很小(Figure 4E, 4F) 。而且，我們分析了腫瘤中Twist1, Vimentin 和 circ-10720 的相關(guān)性。結(jié)果顯示三者的表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)(Figure 4G) 。血清AFP表達(dá)量與circ-10720 表達(dá)量一致。因此這些結(jié)果說明circ-10720 可以促進(jìn)腫瘤生長和Vimentin表達(dá)；體內(nèi)肝癌敲低circ-10720可以阻礙Twist1對(duì)Vimentin表達(dá)促進(jìn)作用。

5 DEN誘導(dǎo)的TetOn-Twist1小鼠肝癌模型沉默circ-10720可抑制Twist1誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移

    為了研究敲低circ-10720對(duì)Twist1引起的腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，我們建立DEN誘導(dǎo)的TetOn-Twist1轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌模型。為了產(chǎn)生肝癌，TetOn-Twist1小鼠使用DEN處理產(chǎn)生腫瘤，接下來每兩周注射TCPOBOP促進(jìn)腫瘤生長。處理結(jié)束后，將產(chǎn)生肝癌的小鼠自由分成兩組，一組喂無doxycycline水，第二組喂有doxycycline水(Twis1t group) ，促進(jìn)Twist1表達(dá)。7天后，Twist1 group組一半的小鼠靜脈注射si-circ-10720（Twi + si-circ-10720 group），另一半靜脈注射siRNA對(duì)照(Twi + siRNA ctrl group) (Figure 5A) 。人類Cul2基因位于10號(hào)染色體，而小鼠Cul2基因位于18號(hào)染色體，blast分析發(fā)現(xiàn)人與小鼠Cul2基因mRNA有91%的相似度。人circ-10720由6-12外顯子組成，小鼠Cul2基因6-12外顯子與人類的高度相似，尤其是人與小鼠的6和12外顯子的反向剪切位點(diǎn)。人與小鼠6和12號(hào)外顯子分別有89% and 93%的相似性。因此小鼠的6-12外顯子也可能形成circRNA(Supplementary Figure S7A)。人與小鼠circ-10720的相似度是91% (Supplementary Figure S7B) 。在兩個(gè)circRNAs的反向連接處發(fā)現(xiàn)32個(gè)相同的堿基。因此人類的si-circ-10720同樣適合小鼠。

    TetOn-Twist1小鼠肝癌模型，檢測小鼠肝產(chǎn)生瘤的數(shù)量。結(jié)果顯示doxycycline處理的小鼠腫瘤數(shù)量顯著上升，而注射si-circ-10720的小鼠則顯示抵消的結(jié)果(Figure 5B) 。而且，我們使用FISH檢測了circ-10720的表達(dá)水平。結(jié)果顯示Twi + siRNA ctrl 組表達(dá)量增加而Twi + si-circ-10720組表達(dá)量下降(Figure 5C) 。Twi + siRNA ctrl 組肝腫瘤組織中Twist1 and Vimentin的表達(dá)量上升，而Twi + si-circ-10720 組敲低circ-10720則阻礙Twist1對(duì)Vimentin的影響。E-cadherin的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)相反(Figure 5D) 。而且我們分析了肝腫瘤中Twist1, Vimentin and circ-10720表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示三者呈正相關(guān)(Figure 5E) 。血清AFP表達(dá)水平與circ-10720 in control, Twi + siRNA ctrl, and Twi + si-circ-10720一致(Figure 5F) 。數(shù)據(jù)顯示DEN-doxycycline誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中敲低circ-10720可以抑制Twist1對(duì)腫瘤生長，轉(zhuǎn)移和Vimentin表達(dá)的促進(jìn)效應(yīng)。

6 circ-10720作為肝癌分子標(biāo)志物

    為了了解更多circ-10720在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，拓寬其在臨床病理學(xué)中的作用。我們收集了388例肝癌樣品，使用FISH分析了circ-10720的表達(dá)水平。對(duì)circ-10720和Vimentin的表達(dá)水平相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者呈正相關(guān)(r=0.439, P=0.000) (Figure 6A) 。Kaplan-Meier分析顯示circ-10720/Vimentin的表達(dá)與75例病人更短的生存期有關(guān)。生存期中值由80個(gè)月下降到28.5月(Figure 6B) 。而且，我們分析了circ-10720表達(dá)水平和肝癌臨床分期病理分級(jí)的關(guān)系。臨床分期I-II，77.7%的病人circ-10720低表達(dá)，23.2%的高表達(dá)。而III-IV則分別是22.3% and 76.8%(P=0.000) (Figure 6C) 。circ-10720低表達(dá)和高表達(dá)組中病理分級(jí)III分別占6.7% 和22.3%(P=0.004)(Figure 6D) 。circ-10720低表達(dá)和高表達(dá)組中轉(zhuǎn)移的比例分別是25.9%和 51.1%(P=0.035) (Figure 6E) 。而且對(duì)兩組的AFP表達(dá)水平也進(jìn)行了檢測。circ-10720高表達(dá)組AFP表達(dá)水平顯著高于circ-10720低表達(dá)組(Figure 6F) 。circ-10720表達(dá)水平與hepatitis B markers的表達(dá)水平并不一致(Figure 6G) 。這些發(fā)現(xiàn)說明circ-10720與腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)，circ-10720可以作為肝癌分子標(biāo)志物，除了hepatitis B病人中。

5 討論

    肝癌中Twist1在EMT過程中促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的作用已經(jīng)有研究過。高表達(dá)的Twist1在多種腫瘤中與更短的生存時(shí)間相關(guān)，如心臟，胃，卵巢和肺等癌(Kaplan-Meier plotter database, Supplementary Figure S8A)，以及肝癌(Supplementary Figure S8B) 。本研究，ChIP-seq結(jié)果顯示Twist1可以結(jié)合Cul2基因啟動(dòng)子區(qū)，熒光素報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證Twist1可以促進(jìn)Cul2基因啟動(dòng)子區(qū)活性。我們發(fā)現(xiàn)在Twist1過表達(dá)肝癌細(xì)胞中，Cul2前體mRNA表達(dá)量升高而其mRNA和蛋白的表達(dá)量下降。因此，Twist1可以促進(jìn)Cul2的轉(zhuǎn)錄而非翻譯。Cul2是一個(gè)抑癌蛋白，因?yàn)槠渑cvon Hippel-Lindau (VHL) 基因有關(guān)，并與泛素化HIFα降解有關(guān)。但也有報(bào)道，Cul2是正常的血管生成所需要的，并與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，可以促進(jìn)胃癌的發(fā)展。本研究，我們分析了75例肝癌組織，發(fā)現(xiàn)Cul2基因的表達(dá)水平與肝癌轉(zhuǎn)移沒有顯著相關(guān)性。因此，我們推斷Twist1可能影響Cul2 circRNA表達(dá)和功能。

    近期，發(fā)現(xiàn)circRNAs是由通過非常規(guī)的剪接方式形成。人們發(fā)現(xiàn)許多癌中各種各樣的circRNAs發(fā)揮著競爭性內(nèi)源RNA的功能。有趣的是一個(gè)基因可以通過可變的反向連接點(diǎn)形成多種circRNAs。而且circRNAs相比于線性RNAs更偏好某些外顯子。本研究，我們發(fā)現(xiàn)外源表達(dá)的Twist1可以促進(jìn)Cul2的轉(zhuǎn)錄和Cul2相關(guān)circRNAs的形成。circ-10720與不良預(yù)后相關(guān)，可以促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移和發(fā)展。一系列證據(jù)說明，Twist激活及Twist誘導(dǎo)Cul2 circRNAs是EMT過程中極為重要的。

    腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移涉及到一系列的生物學(xué)過程，腫瘤細(xì)胞能夠克服正常組織設(shè)置的多種障礙。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，可以維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架。他可以調(diào)動(dòng)多種涉及細(xì)胞粘附和遷移的蛋白。盡管人癌細(xì)胞中，Vimentin可以受到Twist1的誘導(dǎo)，但其具體的機(jī)制尚不清楚。本研究我們發(fā)現(xiàn)Twist1通過間接的通路介導(dǎo)circ-10720吸附miRNA調(diào)控Vimentin的表達(dá)。確實(shí)，我們的結(jié)果顯示Twist1引起circ-10720上調(diào)，吸附可以作用于Vimentin的miRNAs，引起Vimentin轉(zhuǎn)錄后水平的升高。敲低circ-10720可抑制Twist1對(duì)Vimentin調(diào)控的影響。在PDTX and DEN-induced TetOn-Twist肝癌小鼠模型中，小鼠經(jīng)瘤內(nèi)或靜脈注射si-circ-10720。結(jié)果顯示，沉默的circ-10720可以阻礙Twist1對(duì)Vimentin的促進(jìn)作用，并影響肝癌細(xì)胞惡化和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果說明Vimentin受到Twist1間接的調(diào)控，暗示了circRNA在EMT過程中的重要作用。

    在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，我們均檢測了circ-10720在促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用。使用基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)譜確認(rèn)circ-10720上調(diào)基因與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。組織樣品病理學(xué)分析顯示circ-10720與不良預(yù)后和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，并可以作為潛在分子標(biāo)志物。盡管，本研究EMT轉(zhuǎn)化中癌基因circ-10720可以介導(dǎo)Twist1對(duì)Vimentin的調(diào)控，我們沒有研究Twist1調(diào)控Cul2 RNA可變剪接的機(jī)制，不了解是否有其他轉(zhuǎn)錄因子參與這個(gè)過程。因此，Twist1是如何調(diào)控Cul2 RNA的機(jī)制仍有待研究。總之，我們揭示了Twist1調(diào)控Vimentin的機(jī)制。Twist1可以結(jié)合到Cul2的啟動(dòng)子區(qū)，并促進(jìn)Cul2環(huán)狀RNA的表達(dá)，進(jìn)而通過吸附Vimentin目標(biāo)miRNAs促進(jìn)Vimentin表達(dá)(Figure 7) 。circ-10720也能夠促進(jìn)EMT過程，腫瘤轉(zhuǎn)移和惡化。而且circ-10720的表達(dá)與Twist1和Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)。數(shù)據(jù)顯示circ-10720介導(dǎo)Twist1調(diào)控Vimentin，并在EMT過程中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于惡性腫瘤開發(fā)基于circRNA的診斷和治療有幫助。

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