Circular RNAs are differentially expressed in liver ischemia/reperfusion injury model

文字：[大][中][小] 2018/11/1 瀏覽次數(shù)：

一鍵分享

小鼠肝缺血/再灌注損傷模型circRNAs表達譜分析

期刊：JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY 影響因子：3.085

發(fā)表單位：中山大學附屬第三醫(yī)院

1 摘要

肝缺血/再灌注Liver ischemia/reperfusion (I/R)病人由于引發(fā)強烈的炎癥反應具有很高的死亡率。然而I/R損傷的病理機制并不清楚。近期研究顯示circular RNAs在多種人類疾病中發(fā)揮重要作用。本研究通過血檢及hematoxylin-eosin(HE)染色確診I/R損傷發(fā)生。提取樣品total RNA用于RNAseq掃描差異表達的circRNAs，而后使用qPCR驗證。并對差異表達的circRNAs做了GO，KEGG富集分析以推斷其功能。凝膠電泳和RNase R處理驗證circRNAs的成環(huán)結構。生信分析發(fā)現(xiàn)I/R損傷小鼠模型中有一些circRNAs發(fā)生了差異表達。GO分析了其在生物學過程，細胞組分，分子功能三個方面的作用。同時，KEGG富集發(fā)現(xiàn)Hippo signaling pathway與I/R損傷模型相關。為了確認RNAseq數(shù)據(jù)準確性，對2上調，3下調circRNAs使用瓊脂糖凝膠和RNase R處理的方式進行了驗證。簡而言之，本研究對研究I/R損傷提供了新的角度，新的和潛在高效的靶標。

2 材料方法

2.1 I/R損傷小鼠模型

所有動物實驗已獲得中山大學倫理委員會的批準。I/R損傷小鼠模型根據(jù)之前報道的方法進行。C57BL/6小鼠，年齡8-10周，術前饑餓處理24小時，可以飲水。腹膜注射80 mg/kg ketamine (Nembutal, St. Louis, MO)對其麻醉。實驗組與對照組均包含5只。每個小鼠進行中線剖腹探查。金屬微脈管夾吸取流到左側和中側肝頁血液60min，引起肝缺血。松開微脈管夾6h，再將血液灌注回去。縫合腹腔。對照組打開腹腔暴露肝頁不做任何操作。動物溫控設備控制體溫。灌注完之后收集麻醉小鼠的血液制備血清。獲得血液后，殺掉小鼠，獲取缺血肝，液氮速凍，-80℃保存用于后續(xù)實驗。

2.2 生化分析

商業(yè)試劑盒檢測血清轉氨酶ALT and AST活性。ALT activity assay kit (ab105134, Abcam, Cambridge, MA)檢測alanine transaminase (ALT)活性。血清加入到含有反應液的微孔板中。微孔板讀取儀(Biotek, Winooski, VT)讀取570nm處光密度。AST activity assay kit (MAK055, Sigma, St. Louis, MO)檢測Aspartate aminotransferase (AST)活性。與反應液37°C孵育2-3分鐘。每5分鐘測量其在450nm處吸收值，直到大部分樣品的值高于最大值標準。計算ΔA450，基于ΔA450與反應時間的比值計算AST活性。

2.3 酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

提取肝 I/R損傷小鼠模型動脈血。ELISA法計算血清IL-1β and TNF-α密度。包被后用PBST緩沖液清洗，1% BSA封閉37℃孵育1h。然后加入anti-IL-1β or TNF-α抗體和辣根過氧化物抗體37℃孵育1h。加入發(fā)色底物3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine后檢測。EnSpire multimode plate reader (Perkin Elmer, Waltham, MA) 450nm讀取吸收峰。

2.4 HE染色

肝臟切片二甲苯脫蠟，酒精脫水。然后蘇木紫染色8分鐘，浸入0.2%氨水或浸入碳酸鋰溶液1min。浸完95%酒精后，切片伊紅-熒光桃紅復染1分鐘。最后二甲苯固定。Nikon microscope (ECLIPSE 90i, Nikon, Tokyo, Japan)拍照。

2.5 RNAseq

RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Germany)提取樣品total RNA。Agilent bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara,CA)評估樣品完整性。RNA Clean XP Kit (Beckman Coulter, Carlsbad, CA) and RNase-free DNase Set (QIAGEN)純化RNA。NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Waltham, MA)計算RNA質量和密度。為了進行circRNA測序，RNase R (Epicenter, Madison, WI)消化線性RNA。1ug的RNA使用VAHTSTM mRNA-seq v2 library Prep Kit for illumina構建文庫。對于mRNA測序，磁珠選擇含有polyA尾的mRNA。RNA片段化并合成雙鏈。末端修復并添加A。連接測序接頭。而后，進行PCR擴增。Agilent bioanalyzer 2100檢測文庫質量。Illumina Hiseq 4000上機測序。R軟件進行后續(xù)表達量歸一化及數(shù)據(jù)分析。差異表達的circRNAs或mRNA選擇條件為q-value < 0.05 and fold change > 2.0。

2.6 RT-PCR

TRIzol reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA)提取total RNA。2ug的total RNA進行反轉錄。使用one-step RT-PCR kit合成cDNA。反應液37℃孵育15分鐘。85℃ 15分鐘終止反應。SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japan)，ABI 7300 real-time PCR thermal cycle instrument (ABI, Waltham, MA)實時定量。反應系統(tǒng)包括混合液，引物，cDNA模板。ΔΔCt法計算基因相對表達量。

2.7 GO富集分析

GO下載于GO consortium (http://www.geneontology.org/)，GO注釋基于NCBI LocusLink (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db = gene)。對差異表達的circRNAs進行GO歸類，包括分子功能，細胞組分，生物學過程三部分。差異表達基因的富集分析使用(DAVID) 6.7 web server (https://david.ncifcrf.gov)，參數(shù)默認。

2.8 KEGG富集分析

KOBAS 2.0分析KEGG通路。Benjamini and Hochberg's方法對p值校正，adjusted P-value < 0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2.9 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式為mean ± SEM。Unpaired Student's t-tests差異分析。P-value < 0.05認為有顯著性差異。

3 結果

3.1 建立小鼠I/R損傷模型

為了確定小鼠I/R損傷模型是否成功，我們首先檢測了血清AST and ALT表達量。數(shù)據(jù)顯示其表達量相對于對照組織顯著增加(Figures 1A and 1B, P < 0.01)。然后，我們對炎癥因子進行定量。ELISA數(shù)據(jù)顯示TNF-α (P < 0.05) and IL-1β (P < 0.01)密度均顯著增加(Figures 1C and 1D)。結果說明小鼠I/R損傷肝炎癥上升。而且HE染色評估I/R損傷肝壞死。我們發(fā)現(xiàn)相比于對照組織，模型壞死區(qū)明顯變大。壞死區(qū)為實線區(qū)(Figure 1E)。各種數(shù)據(jù)說明，小鼠I/R損傷模型已成功建立。

3.2 生物信息學分析小鼠I/R損傷模型差異表達的circRNAs

RNAseq指出小鼠I/R損傷模型中差異表達的circRNAs(Figure 2A)。GO分析指出差異表達circRNAs關聯(lián)的生物學過程，細胞組分，分子功能(Figure 2B)，GO富集列表在補充材料中。KEGG分析顯示Hippo signaling pathway或許是引起circRNAs差異表達的一個重要因素(Figure 2C)。

3.3 小鼠I/R損傷模型差異表達的circRNAs驗證

我們使用RT-PCR驗證差異表達的circRNAs。根據(jù)RNAseq數(shù)據(jù)，我們選擇5個差異表達最明顯的circRNAs，包括兩個上調的chr9:24278218|24290173 and chr3:94743568|94744148，以及三個下調的chr7:112740400|112743713, chr18:12887129|12888626, and chr3:88805695|88811799 (Table 1)。qPCR顯示chr3:94743568|94744148的表達水平顯著增加(P < 0.05)，而chr9:24278218|24290173的水平?jīng)]有顯著改變(Figure 3A)。而且，chr7:112740400|112743713 (P < 0.001), chr18:12887129|12888626 (P < 0.05) and chr3:88805695|88811799(P < 0.001)均顯著降低(Figure 3B)。接下來我們驗證了上述5個circRNAs成環(huán)的可能性。RT-PCR顯示均具有成環(huán)的特性，GAPDH作為對照(Figures 4A and 4B)。成環(huán)也經(jīng)過RNase R消化實驗驗證(Figure 5A-E)。消化之后，線性RNA顯著下降，而circRNAs沒有顯著變化(Figure 5A-E)。最后對PCR產(chǎn)物Sanger測序驗證環(huán)化位點（Figure 6）。因此，我們可以確信，小鼠肝I/R損傷模型確實有一些circRNAs發(fā)生了差異表達。

4 討論

本研究，我們發(fā)現(xiàn)小鼠肝I/R損傷模型中有一些circRNAs發(fā)生了差異表達，并通過生物信息學分析預測了他們的功能。本研究為未來治療肝I/R損傷提供了一些新的可能。

其他研究中證明建立鼠肝I/R損傷模型流程是有效的。本研究我們也使用三種方法證明肝I/R損傷模型的建立是成功的。三種方法包括AST/ALT水平，炎癥因子檢測和壞死檢測，這些方法廣泛運用評估I/R損傷模型。首先，天門冬氨酸鹽轉移酶能夠催化天門冬氨酸鹽，a-酮戊二酸成草酰乙酸鹽和谷氨酸鹽。而ALT可以催化L-丙氨酸成α-酮戊二酸。這兩種酶在醫(yī)學上常用于診斷肝損傷和肝中毒。此處兩種國美表達量升高，表明肝組織損傷。第二，肝I/R損傷模型炎癥因子的密度升高。與之前報道的一致，即IL-1β可以驅動I/R損傷模型炎癥。第三，I/R損傷模型壞死嚴重。對肝I/R損傷模型壞死的機制了解很少，顯示關鍵的壞死分子在壞死區(qū)域并沒有顯著增加?？紤]到I/R損傷引起的凋亡，壞死也是I/R損傷一個很好的指示因子。因此可以看出我們建立的I/R損傷比以往的建立的更好。

通過生物信息分析，我們發(fā)現(xiàn)一些circRNAs在I/R損傷模型中有差異表達。然而這些circRNAs的功能機制并不清楚。根據(jù)之前在別的疾病上的報道，circRNAs在I/R損傷的功能可能有以下幾種。首先是circRNA-miRNA方面，circRNAs可以調控miRNAs的功能進而在轉錄調控中發(fā)揮重要作用。circRNAs與miRNAs的關系以及協(xié)作功能在其他人類疾病中廣泛研究，可以影響調控，血管形成，侵襲，代謝等。因此，可能是circRNAs-miRNAs關系調控肝損傷進程，差異表達的circRNAs吸附的miRNAs有待后續(xù)進一步確定。第二，circRNAs可能調控了幾個重要的信號通路進而影響I/R損傷。在癌發(fā)展時，circRNAs可以調控幾種重要的信號通路如wnt/beta-catenin, p21-CDK2, and Cyclin A, p-CDK2 pathway。然而依然不清楚circRNAs是如何影響肝I/R損傷的，推測是某些信號通路調控了此過程，這需要進一步研究。第三，circRNAs調控細胞動態(tài)。Hirschsprung's disease中circRNAs可以調控細胞的遷移和增殖。而且circRNA-Foxo3可以促進癌細胞凋亡。因此，這可能是circRNAs的一個機制，即肝I/R損傷后能夠影響細胞凋亡和增殖。以上幾點是以后工作的方向。

綜上，本研究我們在肝I/R損傷模型中發(fā)現(xiàn)了一些差異表達的circRNAs。對其環(huán)狀特性進行了驗證。因此，這些circRNAs或許可以作為肝I/R損傷新的治療靶點。這些circRNAs在肝I/R損傷的出現(xiàn)，發(fā)展的功能需要未來進一步研究。

5 研究思路

材料：

實驗組與對照組均包含5只，RNAseq測序數(shù)量不詳。

方法：

1 建立模型

肝I/R損傷建立，生化分析，酶聯(lián)免疫分析，HE染色。

2 RNAseq 去線性處理，鏈特異性建庫，具體分析流程不詳。

3 qPCR 驗證。

4 GO富集分析使用(http://www.geneontology.org/)，(DAVID) 6.7 web server (https://david.ncifcrf.gov)，KEGG分析使用KOBAS 2.0。

備注：前面實驗方法提到了用polyA建庫測序獲取mRNA信息，也提到DAVID進行GO富集分析，但后續(xù)結果，討論中均沒有提及。circRNAs整體特征，circRNAs差異的數(shù)量多少，上下調多少，均沒有提及，缺乏重要信息，懷疑RNAseq沒有獲得較好的結果。

微信掃描二維碼關注微信公眾號了解更多RNAseq咨詢信息