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相關(guān)文獻(xiàn)
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Expression profile of circular RNAs in infantile hemangioma detected by RNA-Seq
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RNAseq研究嬰兒血管瘤circRNAs表達(dá)譜
期刊：MEDICINE 影響因子：1.804
發(fā)表單位：南京市婦幼保健院醫(yī)療美容科
1 摘要
背景：circular RNAs（circRNAs）是一類新出現(xiàn)的廣泛存在的非編碼RNAs，在各種生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。然而，對嬰兒血管瘤infantile hemangioma（IH）中circRNAs的特征和功能并不了解。
方法：本研究，我們用RNAseq技術(shù)和circRNAs預(yù)測研究circRNAs在嬰兒血管瘤組織和正常配對皮膚組織中circRNAs的特征。對個別circRNAs進(jìn)行RT-PCR驗證。
結(jié)果與結(jié)論：嬰兒血管瘤相比正常配對皮膚組織中，共發(fā)現(xiàn)9811個circRNAs，249個差異表達(dá)，包括124個上調(diào)，125個下調(diào)。qPCR驗證了一些差異表達(dá)circRNAs（hsa_circRNA001885 and hsa_circRNA006612）。對差異表達(dá)circRNAs進(jìn)行GO和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)涉及許多生物學(xué)過程如binding, protein binding, gap junction, and focal adhesion。使用miRanda預(yù)測了幾個circRNAs的microRNAs。本研究我們發(fā)現(xiàn)circRNAs在嬰兒血管瘤中潛在的重要性，及對于治療的潛在價值。
縮略語：ceRNAs = competitive endogenous RNAs, circRNAs = circular RNAs, GAPDH = glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GO = gene ontology, IH = infantile hemangioma, KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, lncRNAs = long noncoding RNAs, miRNA = microRNA, MREs = microRNA response elements, mRNAs = messenger RNAs, qRT-PCR = realtime quantitative PCR, RNA-Seq = RNA sequencing, SD = standard deviation.
2 材料方法
2.1 倫理聲明
本研究獲得南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。嬰兒血管瘤患者在我院接受外科治療，手術(shù)獲取其血管瘤組織和正常配對皮膚組織，已獲得父母知情同意。
2.2 組織樣品
三個不同病人獲取增殖毛細(xì)血管血管瘤和配對正常皮膚組織。常規(guī)病理檢查判斷為增值性血管瘤。收集的皮膚組織立即液氮凍存，以備total RNA提取。病人信息如Table 1。
2.3 total RNA提取
Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)提取組織樣品total RNA。NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, MA)檢測RNA純度，Qubit 3.0 Fluorometer (Life Technologies, CA)對RNA密度進(jìn)行定量。Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA)評估RNA完整性。
2.4 文庫準(zhǔn)備，RNA測序
VAHTS Total RNA-Seq (H/M/R) Library Prep Kit構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫，構(gòu)建流程如下：首先用特異性探針，RNase H and DNA polymerase I去除rRNA。而后純化，二價陽離子適宜溫度將RNA片段化。反轉(zhuǎn)錄酶和自由引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA, 而后DNA polymerase I, RNase H, and dNTPs (dUTP, dATP, dGTP, and dCTP)合成第二鏈。對cDNA添加A，并連接接頭序列。選擇適宜長度的cDNA用于測序，VAHTS DNA Clean Beads選擇文庫長度，UDG enzyme消化第二條鏈，進(jìn)行PCR擴增，文庫純化。Illumina Hiseq X10 platform測序，模式為PE150。
2.5 質(zhì)控
自寫perl腳本處理raw reads。去除含有接頭，“N”超過5%，低質(zhì)量reads（低質(zhì)量堿基占整條reads 50%，堿基質(zhì)量值低于10認(rèn)為是低質(zhì)量的堿基）。同時計算clean reads的Q20, Q30, and GC含量。后續(xù)分析基于clean reads。
2.7 raw reads過濾
通過去除含有接頭，ploy-N 和低質(zhì)量reads用于后續(xù)分析。過濾步驟如下：去除含有接頭的reads；去除含有poly-N reads,比例大于5%；去除低質(zhì)量reads（堿基質(zhì)量值Q≤10比例大于50%）。后續(xù)分析基于clean data。
2.6 比對到參考基因組
參考基因組及注釋文件下載于UCSC（hg38）。Bowtie (v2.1.0)構(gòu)建參考基因組索引，TopHat (v2.1.1)將成對clean reads比對到參考基因組。
2.8 circRNAs預(yù)測
使用circRNA_Finder預(yù)測circRNAs(https://github.com/bioxfu/circRNAFinder)。首先clean reads使用Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)比對到參考基因組。然后對于未必對的reads，circRNA_Finder鑒定back-splice reads并確認(rèn)是否是circRNAs。最后，使用circRNAAnno對circRNAs進(jìn)行注釋和統(tǒng)計，獲得circRNAs序列用于后續(xù)分析。
2.9 circRNAs差異表達(dá)分析
circRNAs的表達(dá)量用“Transcripts Per Million” (TPM)校正。DESeq基于負(fù)二項分布檢驗進(jìn)行差異表達(dá)分析。差異表達(dá)閾值設(shè)置為FDR≤0.05 and |log2Fold change| ≥1。
2.10 qPCR驗證RNAseq測序結(jié)果
為了確定RNAseq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，使用qPCR在12個其他嬰兒血管瘤組織進(jìn)行驗證。病人信息如table 1。qPCR引物如 table 2。GAPDH用于內(nèi)參，使用2(-△△Ct)相對定量。
2.11 circRNAs來源基因GO，KEGG功能富集分析
基于統(tǒng)計模型，我們做了GO，KEGG富集分析。差異表達(dá)circRNAs來源基因用GOseq R包分析，使用基因長度進(jìn)行校正。Benjamini and Hochberg’s方法對P-values進(jìn)行校正。corrected P<.05的GO術(shù)語認(rèn)為有顯著富集。展示前10個術(shù)語。KOBAS軟件分析KEGG通路，展示top20個通路。
2.12 circRNA-microRNA關(guān)系預(yù)測
miRanda (http://www.microrna.org/) 預(yù)測circRNA-microRNA關(guān)系。webserver (http://circos.ca/)繪制circRNA與miRNAs circos圖。
2.13 統(tǒng)計分析
SPSS 20.0 software package (SPSS, Chicago, IL) an independent-sample t test 檢測2組。mean±standard deviation (SD)呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，并至少三重復(fù)。P<.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 RNAseq技術(shù)比較血管瘤和配對正常皮膚組織circRNAs表達(dá)譜
本研究收集未進(jìn)行任何治療的15個血管瘤及皮膚組織。如Table 1，病人平均年齡（標(biāo)準(zhǔn)差）是7月6天（2月15天）。為了研究血管瘤circRNAs差異表達(dá)譜，我們對3個自由選擇的血管瘤組織和配對正常皮膚組織做了RNAseq。所有樣品circRNAs的長度如Figure 1 A。大部分circRNAs的長度低于500nt。249個circRNAs差異表達(dá)，包括124個上調(diào)，125個下調(diào)。聚類分析展示了249差異表達(dá)的circRNAs(Fig. 1 B) (foldchange ≥ 2, P≤ .05)。
3.2 qPCR驗證
為了驗證RNAseq數(shù)據(jù)，我們自由選擇了6個差異表達(dá)的circRNAs（table 3）。qPCR對其他12個獨立的血管瘤，皮膚組織（table 1）進(jìn)行定量。結(jié)果顯示6個circRNAs的在qPCR與RNAseq的數(shù)據(jù)表達(dá)趨勢是一致的。6個circRNAs中，hsa_circRNA001885, and hsa_circRNA006612，表達(dá)是12.33- and 7.13-fold，高于配對皮膚組織（Fig. 2）。
3.3 對差異表達(dá)的circRNAs來源基因進(jìn)行GO, KEGG富集分析
近期研究顯示circRNAs可以調(diào)控來源基因的表達(dá)。因為，我們對差異表達(dá)circRNAs的來源基因進(jìn)行GO，KEGG富集分析。GO結(jié)果顯示來源基因大部分與cellular component organization or biogenesis, binding, protein binding, and intracellular organelle parts有關(guān)(Fig. 3)。KEGG結(jié)果顯示與gap junction, focal adhesion, and adherens junction有關(guān)(Fig. 4)。
3.4 circRNA與miRNA關(guān)系
許多證據(jù)表明circRNAs可以發(fā)揮miRNA海綿吸附作用。The competitive endogenous RNAs (ceRNA)具有miRNA response elements(MREs)，比如circRNAs, mRNAs, lncRNAs均能競爭結(jié)合miRNA。因為我們使用miRanda軟件掃描6個circRNAs的MREs。結(jié)果顯示有些miRNAs與這些特別的circRNAs有關(guān)(Table 4)。其中有63 miRNAs（高含量）能潛在結(jié)合hsa_circRNA000227 (Fig. 5), 15 miRNAs可以結(jié)合hsa_circRNA001885，36 miRNAs可以結(jié)合hsa_-circRNA006612。
4 討論
作為一種血管腫瘤，血管瘤是小孩中出現(xiàn)頻率最高腫瘤的一種。血管瘤的致病機理得到廣泛研究，并提出了幾種理論。內(nèi)皮驅(qū)動細(xì)胞理論，F(xiàn)olkman Klagsbrun胎盤理論，血管再生理論，組織缺氧理論是目前接受度最高的幾種。目前為止，有報道過使用circRNA芯片研究血管瘤，并鑒定到234個上調(diào)，374個下調(diào)circRNAs。本研究，我們基于RNAseq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)249個circRNAs異常表達(dá)，124個上調(diào)，125個下調(diào)。
有報道稱細(xì)胞質(zhì)中circRNAs的含量豐富，保守，穩(wěn)定，并起源于線性RNA模板的反向剪接或者外顯子跳躍。大量的文獻(xiàn)通過RNAseq技術(shù)反向剪接發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計的circRNAs。最近有研究認(rèn)為芯片鑒定circRNAs表達(dá)譜的效率要比RNAseq技術(shù)高。我們的數(shù)據(jù)與芯片的數(shù)據(jù)并不完全一致。根據(jù)來源基因，我們發(fā)現(xiàn)249個異常表達(dá)的circRNAs有47個來源基因可以在circRNA芯片中發(fā)現(xiàn)(fold change ≥ 2, P<.5)。
circRNAs最近成為一個新的明星分子在調(diào)控大量的生物學(xué)和致病過程中發(fā)揮重要作用。最近研究顯示exon-intron circRNAs主要位于核內(nèi)，與U1 snRNP作用通過順式調(diào)控增強來源基因的表達(dá)量。我們的研究顯示249個異常表達(dá)的circRNAs的來源基因主要與binding, protein binding, intracellular organelle part, gap junction, focal adhesion and adherens junction有關(guān)，提示這些circRNAs可能參與這些生物學(xué)過程，分子功能和信號通路的。進(jìn)一步推測血管瘤circRNAs潛在的機制，有助于揭示其生物學(xué)原因并對評估和治療血管瘤提供有用的信息。
對6個驗證circRNAs(Table 3)的來源基因，我們發(fā)現(xiàn)TM7SF3 and GUCY1A2也能在芯片數(shù)據(jù)中找到。因此 hsa_circRNA002136 and hsa_circRNA001885可能是最有希望的研究目標(biāo)。TM7SF3能通過減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激維持蛋白動態(tài)平衡促進(jìn)細(xì)胞存活。過表達(dá)TM7SF3可以抑制caspase 3/7激活。FAM117B是一個新鑒定的在基因組范圍內(nèi)有意義的易感位點，鑒定于歐洲病例對照種群研究。作為一個AGO蛋白，AGO4能結(jié)合small RNA并介導(dǎo)與互補靶標(biāo)RNA的分開。GFM1突變可以引起新生兒線粒體肝性腦病。JMJD5/KDM8對于哺乳動物基因組的穩(wěn)定是極為重要的。因此這些特別的circRNAs可能影響血管瘤中的這些通路。需要更多的研究揭示這些circRNAs的功能。
CircRNAs可以通過堿基互補配對海綿吸附miRNA。近期有研究報道，circHIPK3能夠吸附9 miRNAs，擁有18個潛在的結(jié)合位點。circMTO1能夠能過吸附致癌的miRNA-9促進(jìn)p21表達(dá)進(jìn)而抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)程，說明circMTO1可能是肝細(xì)胞癌治療的一個潛在靶標(biāo)。我們的研究發(fā)現(xiàn)許多miRNAs能夠結(jié)合特定的circRNAs，使其在血管瘤中發(fā)揮類似作用。一些研究報道m(xù)iR-130a, miR-382, miR-9, miR-939 and the let-7家族與血管瘤的病理過程相關(guān)。因此，很有可能hsa_circRNA005537海綿吸附let-7c-3p在血管瘤進(jìn)展分子機制中發(fā)揮重要作用。CircRNAs, miRNAs, mRNAs的新關(guān)系可以為疾病的致病過程提供一個新的解釋。因此，推斷血管瘤中CircRNAs, miRNAs, mRNAs潛在的機制，有助于揭示其生物學(xué)原因并對評估和治療血管瘤提供有用的信息。
5 研究思路
材料：
3個血管瘤組織，3個配對正常皮膚組織用于RNAseq，另外12個病人樣品用于驗證。
研究過程：
1 RNAseq建庫：去除rRNA, 未去除其他線性RNA，鏈特異性建庫， Hiseq X10 platform測序，模式為PE150。
2 使用circRNA_Finder流程鑒定和定量circRNAs。TPM數(shù)據(jù)歸一化，DESeq進(jìn)行差異表達(dá)分析。
3 GOseq R GO富集分析，KOBAS軟件分析KEGG通路。
4 miRanda預(yù)測circRNA-miRNA關(guān)系，繪制circos圖展示。
5 qPCR進(jìn)行驗證，GAPDH用于內(nèi)參。
結(jié)果展示：
1 circRNA表達(dá)譜：病人信息（Table 1），統(tǒng)計circRNAs長度分布（Figure 1 A），熱圖展示差異表達(dá)的circRNAs（Fig. 1 B）。
2 qPCR驗證：挑選6個circRNAs（table 3），qPCR定量散點圖（Fig. 2）。
3 功能富集分析：GO富集柱狀圖（Fig. 3），KEGG富集散點圖（Fig. 4）。
4 circRNA與miRNA關(guān)系：circRNAs與miRNAs結(jié)合列表（table 4），circos圖（Fig. 5）。
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