Signature of circular RNAs in human induced pluripotent stem cells and derived cardiomyocytes

人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和衍生心肌細(xì)胞circRNA特征

    期刊：Stem Cell Research & Therapy  影響因子：4.211

    發(fā)表單位：蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管研究所

1 摘要

    背景：circular RNAs（circRNAs）是一類新的非編碼RNA調(diào)控分子。雖然通過RNAseq技術(shù)及生物信息分析發(fā)現(xiàn)了大量的circRNAs，但對(duì)組織及疾病特異性的circRNAs研究還很少，不足以推動(dòng) circRNA在基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)踐上的應(yīng)用。本研究的目的是研究人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞human induced pluripotent stem cells (簡(jiǎn)稱hiPSCs) 和多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞hiPSC derived cardiomyocytes (簡(jiǎn)稱hiPSC-CMs)，鑒定心臟或疾病特異性的circRNAs。

    方法：成纖維細(xì)胞產(chǎn)生hiPSCs，進(jìn)而用RPMI+B27培養(yǎng)基激活WNT通路分化成hiPSC-CMs，而后進(jìn)行高通量測(cè)序，使用CIRCexplorer軟件進(jìn)行circRNA的鑒定和定量。并對(duì)circRNA及其來源基因進(jìn)行整合分析以了解兩者的關(guān)系。使用qPCR對(duì)心臟及疾病特異性的circRNAs進(jìn)行確認(rèn)。

    結(jié)果：本研究在hiPSCs和hiPSC-CMs中，共鑒定到5602個(gè)circRNAs，第一次發(fā)現(xiàn)，分化的心肌細(xì)胞中circRNAs的豐富度要高于未分化的hiPSCs細(xì)胞。除了來源基因依賴的表達(dá)，整合分析還發(fā)現(xiàn)了許多非來源基因依賴的circRNA表達(dá)。circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2在心肌分化和人胎兒心臟中呈現(xiàn)選擇性表達(dá)。circSLC8A1在擴(kuò)張型心肌病病人的心臟組織中異常高表達(dá)。

    結(jié)論：hiPSC-CMs circRNAs表達(dá)豐富，心臟特異性的circRNAs比如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2或可作為hiPSC-CMs標(biāo)志物。檢測(cè)異常高表達(dá)circSLC8A1或可作為診斷心臟疾病病理狀態(tài)的一個(gè)方法。

2 材料方法

1 人組織收集

    本研究使用的捐獻(xiàn)成人及胎兒組織，已獲得蘇州大學(xué)和華中科技大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。在正常人身上獲得正常心臟組織，在擴(kuò)張型心肌病心臟移植病人處獲得心臟疾病組織。胎兒的組織比如腦，心臟，肝，脊柱，胃從懷孕9-10周的流產(chǎn)兒身上獲得，并征得病人的同意。

2 成纖維細(xì)胞分離和hiPSCs細(xì)胞誘導(dǎo)

    皮膚活組織切碎，使用膠原酶IV(Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)在Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM; Gibco)培養(yǎng)基上37℃消化6h。尼龍網(wǎng)過濾，用PBS沖洗成纖維細(xì)胞，然后在DMEM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基加入10% 胎牛血清(FBS; Gibco)，37℃，潮濕，5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞長(zhǎng)到不超過5代時(shí)，將細(xì)胞涂抹到包被凝膠及胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，然后使用編碼4個(gè)干細(xì)胞因子(OCT4, SOX2, KLF4 and cMYC) 的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染。5天后轉(zhuǎn)染的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至輻射過的MEF飼養(yǎng)層，并在KSR培養(yǎng)基上培養(yǎng)（DMEM/F12 supplemented with 20% KnockOut Serum Replacement, 4 ng/ml bFGF, 2 mM L-glutamine, 1% MEMnon essential amino acids, and 0.007% 2-mercaptoethanol）。20-30天后，采集ESC-like的單克隆細(xì)胞，并培養(yǎng)在基質(zhì)膠包被的E8培養(yǎng)基上。

3 hiPSCs分化成心肌細(xì)胞

     hiPSCs單層定向分化成心肌細(xì)胞按照之前報(bào)道的方法，并做了一些小的修改。具體步驟參見原文。

4 hiPSCs和hiPSC-CMs的鑒定。

    通過embryoid body（EB），畸胎瘤成型，以及干細(xì)胞標(biāo)志物（OCT4, NANOG, TRA-1-60）免疫熒光染色來證實(shí)hiPSC的多能性。hiPSC-CMs則通過形態(tài)學(xué)分析、鈣瞬變、和心肌細(xì)胞標(biāo)志物（TNNT2,α-SA）免疫熒光染色判斷。

5 RNA測(cè)序

    用RNeasy kit (Qiagen,CA, USA), DNase I (Qiagen) 提取hiPSCs和hiPSC-CMs total RNA。用Ovation®RNA-Seq System V2 (NuGEN, CA, USA)構(gòu)建RNA測(cè)序文庫(kù)，用NEBNext® DNA Library Prep Master Mix Set for Illumina®構(gòu)建barcode文庫(kù)，切除回收250bp片段，HiSeq2000平臺(tái)雙端測(cè)序，平均深度在30 百萬reads。測(cè)序序列先使用TopHat 2.1比對(duì)到人參考基因組GRCh37/hg19。提取未能完全比對(duì)的reads，使用TopHat-Fusion再次比對(duì)到參考基因組。同一序列兩部分能夠比對(duì)到相同的染色體，提取非同一方向的reads，作為候選反向剪接reads（back-spliced junction reads）。反向剪接reads重新比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)有注釋的基因，準(zhǔn)確判斷每個(gè)剪接事件準(zhǔn)確的供體和受體位點(diǎn)。最后剪接reads使用RPB（reads per billion mapped reads, 包括TopHat比對(duì)and TopHat-Fusion比對(duì)）定量。

6 GO分析

    使用Metascape(http://metascape.org)做GO富集分析。

7 siRNA轉(zhuǎn)染knockdown QKI基因

    針對(duì)QKI基因設(shè)計(jì)合成了三種類型的siRNAs，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染hiPSC-CMs，兩種對(duì)hiPSC-CMs QKI基因抑制顯著，用于后續(xù)分析。

8 RT-PCR 和 qPCR

    用PrimeScript reverse transcriptase reagent kit (TaKaRa, Dalian, China)進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，發(fā)散性引物擴(kuò)增circRNA轉(zhuǎn)錄本，凝膠電泳進(jìn)行擴(kuò)增片段可視化。引物如Additional file 1: Table S1。PCR產(chǎn)物用Sanger測(cè)序驗(yàn)證。用SYBR Premix Ex Taq kit (TaKaRa)，在StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems?, CA, USA)進(jìn)行qPCR定量。樣品三個(gè)重復(fù)，qPCR定量時(shí)三重復(fù)。數(shù)據(jù)用18S rRNA校正，2-ΔΔCT分析。

9 統(tǒng)計(jì)分析

    使用Student’s t test or one-way ANOVA對(duì)qPCR的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。p < 0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以mean ± SD形式呈現(xiàn)。

3 結(jié)果

1 鑒定hiPSCs和hiPSC-CMs circRNAs

    使用慢病毒介導(dǎo)的4過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子（OCT4, KLF4, c-MYC and SOX2），誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞重編程為hiPSCs。分離的hiPSCs細(xì)胞在E8培養(yǎng)基上培養(yǎng)(Fig. 1a)，并進(jìn)一步使用多潛能干細(xì)胞標(biāo)志物NANOG, SOX2, OCT4 and TRA-1-60（Fig. 1b and Additional file 2: Figure S1A），擬胚體，（Additional file 2:Figure S1B），畸胎瘤成型（Fig.1c, d）驗(yàn)證。hiPSCs進(jìn)一步激活WNT通路誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞，早期中胚層標(biāo)志物基因（BRA），心臟中胚層標(biāo)志物基因（MESP1），心臟特異性前體基因（TBX5）和結(jié)構(gòu)基因（TNNT2, MYH6 and MYH7）均在hiPSC-CMs分化時(shí)呈現(xiàn)階段特異性表達(dá)（Additional file 2:Figure S1C–H）。高表達(dá)的心臟標(biāo)志基因如TNNT2、sarcomeric α-actinin 如Fig. 1e，及典型的鈣瞬變（Fig. 1f）。這些數(shù)據(jù)均說明成功的誘導(dǎo)hiPSCs分化為hiPSC-CMs。

    提取hiPSC，hiPSC-CMs（傳30代）total RNA用于RNAseq，提取測(cè)序reads中反向剪接的reads，使用CIRCexplorer（默認(rèn)參數(shù)）進(jìn)行reads的注釋，定量。只有樣品中該連接點(diǎn)reads覆蓋數(shù)量≥2，才會(huì)繼續(xù)用于后續(xù)分析。用RPB (reads per billion mapped reads)對(duì)表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。一共鑒定到5602個(gè)circRNAs, hiPSC組中有1612個(gè)，hiPSC-CMs組中有4260個(gè)，270個(gè)交集共同存在。另外，超過3500個(gè)circRNA不在circBase數(shù)據(jù)庫(kù)中（Fig. 2a）。hiPSC，hiPSC-CMs分別有614, 2918個(gè)novel circRNAs，說明circRNAs在這兩種細(xì)胞中是特異性存在的。所有鑒定到的circRNAs在Additional file 4: Table S2。

    我們研究了circRNA的基因組特征。大部分的host gene能夠產(chǎn)生1-7個(gè)circRNA轉(zhuǎn)錄本，多circRNAs的host gene數(shù)量少于少circRNA的host gene數(shù)量（Fig. 2b）。相比hiPSC， hiPSC-CMs能產(chǎn)生更多的circRNA轉(zhuǎn)錄本（Fig. 2b）。比如TTN基因我們共鑒定到129個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，這個(gè)基因有非常多的外顯子，而且能編碼很多條紋肌相關(guān)的蛋白（Additional file 4:Table S2）。 然而多能干細(xì)胞基因如OCT4 and NANOG并未檢測(cè)到circRNAs。大部分circRNAs的長(zhǎng)度在200-2500bp之間（Fig. 2c），基因組的整體長(zhǎng)度不超過45kb（Fig. 2d）。外顯子的數(shù)量在1-8個(gè)（Fig. 2e），單外顯子circRNAs外顯子的長(zhǎng)度要遠(yuǎn)長(zhǎng)于多外顯子circRNAs的平均外顯子長(zhǎng)度（Fig. 2f）。

2 circRNAs在hiPSC-CMs 高豐度表達(dá)

    正如Fig. 2a看到的，相比hiPSC，hiPSC-CMs能產(chǎn)生更多的circRNA轉(zhuǎn)錄本。因此，我們計(jì)算了circRNAs reads與所有匹配reads的比例。hiPSC-CMs，hiPSC circRNA的reads數(shù)量占比是17.5% vs 6% (Fig. 3a)。所有結(jié)果均顯示hiPSC-CMs中的circRNA的豐富度要比hiPSC高的多。數(shù)據(jù)同時(shí)顯示兩個(gè)表達(dá)量上升的重要的剪接因子Quaking (QKI) and RNA binding Motif protein 20 (RBM20)與circRNA的形成有關(guān)。qPCR進(jìn)行驗(yàn)證兩個(gè)基因表達(dá)量(Fig. 3c)。

    top 100 circRNAs熱圖(Fig. 3d)顯示circRNAs在hiPSC，hiPSC-CMs呈現(xiàn)特異性表達(dá)。相比hiPSC，hiPSC-CMs大部分circRNAs呈現(xiàn)高表達(dá)，只有很少一部分是下調(diào)的。進(jìn)一步用發(fā)散引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本驗(yàn)證這些差異表達(dá)的circRNAs。hiPSC-CMs 6個(gè)編碼基因(SLC8A1, ARID1A, FNDC3B, CACNA1D, SPHKAP and ALPK2)產(chǎn)生circRNAs的外顯子表達(dá)量更高，相比hESC and hiPSC組，hiPSC-CMs和成纖維細(xì)胞circAASS, circFIRRE and circTMEFF1的表達(dá)量明顯下調(diào)(Fig. 3e) 與測(cè)序得到的結(jié)果一致。circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2或許可以成為心肌細(xì)胞分子標(biāo)志物。

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些分子標(biāo)志物，我們提取心肌細(xì)胞不同分化時(shí)期的total RNA進(jìn)行RT-PCR分析（Fig. 3f）。circALPK2在第4天時(shí)有高表達(dá)，而circSLC8A1, circCACNA1D and circSPHKAP在9,15,30天高表達(dá)。盡管一直存在表達(dá)，circFNDC3B轉(zhuǎn)錄本依然從第9天開始明顯上升。隨后，我們對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測(cè)序（Fig. 3g and Additional file 5: Figure S2）。以上結(jié)果提示circSLC8A1, circCACNA1D and circSPHKAP或可成hESCs or hiPSCs分化為心肌細(xì)胞時(shí)新的分子標(biāo)志物。

    然后我們進(jìn)一步研究剪接因子Quaking在hiPSC-CMs circRNA表達(dá)時(shí)的功能。如Fig. 3h, i，用siRNA抑制QKI的表達(dá)后，circRNAs 包括 circSLC8A1, circFNDC3B, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2的表達(dá)量顯著下調(diào)。結(jié)果說明hiPSC-CMs circRNAs豐富表達(dá)或許剪接因子如QKI的表達(dá)量增加有關(guān)。

3 circRNA與來源基因表達(dá)整合分析

    由于circRNA來源于親本轉(zhuǎn)錄本外顯子的反向剪接而成，我們對(duì)circRNA與來源基因的表達(dá)，做了相關(guān)性分析。首先分析hiPSC，hiPSC-CMs中線性轉(zhuǎn)錄本，基于閾值50 RPKM，一共鑒定到1270個(gè)基因的表達(dá)量超過兩倍(Additional file 6: Figure S3A, Additional file 7: Table S3)。多潛能基因如NANOG, SOX2 and OCT4下調(diào)，而結(jié)構(gòu)基因編碼的心臟終端分化肌相關(guān)的蛋白包括TNNT2, MYL2, MYH6, and MYH7顯著上升。hiPSC上調(diào)基因GO分析主要富集到cell cycle, transcriptional regulation of PSCs, DNA replication and chromatin remodeling at the centromere (Additional file 6: Figure S3C, E)。而hiPSC-CMs上調(diào)的基因主要涉及到heart development, muscle system process, striated muscle cell differentiation等(Additional file 6: Figure S3D, F)。這些分析的結(jié)果也說明了數(shù)據(jù)的可靠性。

    接下來，我們對(duì)hiPSCs and hiPSC-CMs top100 circRNAs及其線性親本RNA的相關(guān)性分析顯示，兩者表現(xiàn)出強(qiáng)烈的正相關(guān)性（Fig. 4a, b）。為了挑選獨(dú)立于基因表達(dá)的circRNAs，我們計(jì)算了每個(gè)基因環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本與線性轉(zhuǎn)錄本的比例（Fig. 4c, d）。大部分circRNA所占的比例是50%。設(shè)置閾值75%，我們發(fā)現(xiàn)有一些circRNAs的表達(dá)與其線性RNA的表達(dá)模式并不一致。相比于hiPSC，hiPSC-CMs組更多circRNA表現(xiàn)出非來源基因依賴的表達(dá)。Additional file 8: Table S4是表達(dá)豐度高且來源基因依賴的circRNAs表達(dá)列表。

    對(duì)差異表達(dá)circRNAs的來源基因進(jìn)行GO分析，如Fig. 4e, f。hiPSCs and hiPSC-CMs表達(dá)豐富的circRNAs來源基因均與covalent chromatin modification, cell cycle and cell morphogenesis等相關(guān)，不過子分類不太相同。而hiPSC-CMs上調(diào)的circRNAs來源基因富集到myocardial function（心肌功能），如heart development, membrane trafficking（跨膜運(yùn)輸）, organelle assembly（細(xì)胞器組裝）, fiber organization（纖維組織）and muscle structure development (Fig. 4f)。而hiPSC特異性的circRNAs的來源基因富集到一些通路如DNA metabolic process, DNA replication等 (Fig. 4e)。

4 人健康及疾病心臟中差異表達(dá)的circRNA

    為了找到更可靠的心臟circRNAs, 人類正常心臟中鑒定到6075個(gè)circRNAs（以前文獻(xiàn)）， 我們?cè)趆iPSC-CMs中鑒定到4260個(gè)circRNAs。如Fig. 5a所示，兩者交集共有897個(gè)circRNAs（Additional file 9: Table S5）。有許多hiPSC-CMs或其他組織特異性的circRNAs，可能是不同階段的hiPSC-CMs，或組織異質(zhì)性引起的。circSLC8A1, circFNDC3B, circSPHKAP and circALPK2包含在897個(gè)重疊的circRNAs中，而circCACNA1D僅在我們的數(shù)據(jù)中鑒定到。

    我們研究了人胎兒組織 中這5個(gè)circRNAs的表達(dá)。4個(gè)circRNA(circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2)在心臟組織中高表達(dá)(Fig. 5b-e)，circFNDC3B的改變不明顯(Fig. 5f )。

    為了評(píng)估使用circRNAs作為心臟疾病標(biāo)志物的可行性，qPCR比較正常人心臟與DCM病人心臟circRNAs表達(dá)水平。眾所周知的一個(gè)心肌病分子標(biāo)志物，natriuretic peptide B (NPPB)在DCM病人心臟中的表達(dá)量顯著高于正常心臟(Additional file 10: Figure S4A)。在5個(gè)circRNAs中，只有circSLC8A1顯著升高(Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4)。

    我們推測(cè)circSLC8A1的上調(diào)依賴于其線性轉(zhuǎn)錄本的升高。為了驗(yàn)證假設(shè)，使用特殊的引物qPCR定量線性轉(zhuǎn)錄本，與我們的推斷一致，SLC8A1線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量也顯著增加(Fig. 6d)。值得注意的是circSLC8A1改變的倍數(shù)要比其線性轉(zhuǎn)錄本改變的倍數(shù)高的多(Fig. 6a, d),這或許是因?yàn)閏ircRNA更穩(wěn)定。盡管CACNA1D線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量顯著降低，但circCACNA1D的表達(dá)確不明顯(Fig. 6b, e)。這與我們之前得到的circCACNA1D與來源基因獨(dú)立表達(dá)的結(jié)果一致(Additional file 8: Table S4)。除了環(huán)狀RNA，SPHKAP, ALPK2 and FNDC3B的mRNA沒有觀察到顯著的差異(Fig. 6 and Additional file 10: Figure S4)。

4 討論

    多能干細(xì)胞包括ESCs and iPSCs，在心臟疾病干細(xì)胞治療上有很大希望。但我們對(duì)心臟發(fā)育和心肌分化機(jī)制了解還很有限，對(duì)于尋找高效的方法產(chǎn)生人源心肌細(xì)胞是個(gè)大障礙。新出現(xiàn)的心臟特異性的circRNAs提示circRNAs或與心臟發(fā)育有關(guān)，并可以作為心肌細(xì)胞和心臟疾病的分子標(biāo)志物。這個(gè)假設(shè)促使我們對(duì)iPSCs 和 hiPSC-CMs的circRNA和mRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究。本研究，我們一共鑒定到5602個(gè)circRNAs。大部分的circRNAs呈現(xiàn)iPSCs或hiPSC-CMs細(xì)胞特異性的表達(dá)。接下來的研究展示了許多高豐度表達(dá)的心臟circRNAs, 如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2。另外，相比正常心臟，circSLC8A1在DCM病人心臟中顯著高表達(dá)。

    我們發(fā)現(xiàn)hiPSC-CMs許多高表達(dá)的circRNAs來源于心臟相關(guān)的基因，涉及到heart development, membrane trafficking and muscle structure development，同樣在存在于與hESC-derived CMs。hiPSC-CMs and hESCCMs表達(dá)最豐富的一個(gè)circRNA是由Solute Carrier Family 8 Member A1 (SLC8A1)的第一個(gè)外顯子環(huán)化而成，這個(gè)基因是心肌膜上的一個(gè)Na(+)-Ca(2+)交換器，能夠在應(yīng)激收縮時(shí)排出Ca(2+)。盡管大部分的circRNAs表現(xiàn)為gene依賴的表達(dá)，我們依然發(fā)現(xiàn)一些circRNAs與其線性的mRNAs表達(dá)呈較差的相關(guān)性?；蛟S是因?yàn)榄h(huán)化后RNA的穩(wěn)定性或獨(dú)特的形成機(jī)制。我們的分析顯示，這類circRNAs在hiPSC-CMs中比例更高。

    本研究的一個(gè)關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是circRNA在分化hiPSC-CMs表達(dá)更豐富而非干細(xì)胞如hiPSCs。hiPSCs僅鑒定到一小部分back-splicing reads，大約只占總比對(duì)reads的6%。而在hiPSC-CMs中，這一比例增加到17.5%。同樣，近期的一些研究發(fā)現(xiàn)，分化的神經(jīng)和動(dòng)物的腦中circRNAs表達(dá)更為豐富。而在增殖的結(jié)腸癌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，circRNA相比于正常組織不那么豐富。這些數(shù)據(jù)說明分化的細(xì)胞能夠激活許多基因促使circRNA的形成或者穩(wěn)定性。此前，報(bào)道兩種RNA結(jié)合蛋白能夠調(diào)控circRNA的環(huán)化。QKI是一個(gè)剪接因子能夠通過結(jié)合在兩端的內(nèi)含子區(qū)誘導(dǎo)外顯子的環(huán)化。RNA binding Motif protein 20 (RBM20), 其缺失可引起DCM，有報(bào)道他對(duì)于TTN轉(zhuǎn)錄本的1-band區(qū)域的環(huán)狀是極為重要的。通過RNAseq和qPCR，我們發(fā)現(xiàn)RBM20心臟特異性表達(dá)，以及QKI的顯著升高。下調(diào)hiPSC-CMs QKI，能夠降低circSLC8A1, circFNDC3B, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2 的表達(dá)，說明QKI在circRNA產(chǎn)生時(shí)發(fā)揮重要作用。而其他能夠激活circRNA表達(dá)的調(diào)控因子的發(fā)現(xiàn)，仍待更多的研究。

    穩(wěn)定性、靈敏性和特異性是分子標(biāo)志物的重要特征。以往研究顯示相比線性RNA，circRNAs能夠抵抗核酸酶降解而具有更長(zhǎng)的半衰期。結(jié)合Tan et al.’s 研究及我們的數(shù)據(jù)顯示hESC-derived and hiPSC-derived CMs細(xì)胞特異性circRNA表達(dá)如circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這4個(gè)分子有選擇性的在胎兒心臟中高表達(dá)。因此，心臟特異性circRNAs或可成為心肌細(xì)胞可選的分子標(biāo)志物。

    許多circRNAs具有成為特殊癌癥疾病或CD28-related CD8(+) T-cell ageing分子標(biāo)志物的潛能。Du et al.發(fā)現(xiàn)circFOXO3在高齡病人和小鼠心臟高表達(dá)，能夠結(jié)合胞質(zhì)抗衰老和抗壓蛋白而促進(jìn)衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，circSLC8A1在DCM病人顯著增加。Tan et al.’s study 顯示circSLC8A1在心臟疾病如DCM, HCM and IHD呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，雖缺乏統(tǒng)計(jì)意義。Tan et al.’s study 缺乏統(tǒng)計(jì)意義，或是因樣本量限制，或是對(duì)照組受到其他因素的影響。最近，Siede et al. 也報(bào)道circSLC8A1在DCM活檢組織高表達(dá)。本研究顯示circSLC8A1與其線性轉(zhuǎn)錄本表達(dá)呈正相關(guān)。circSLC8A1的變化倍數(shù)更高，顯示其環(huán)狀的形式要比線性形式更穩(wěn)定。綜合來看，circSLC8A1或可作為心臟疾病病理狀態(tài)的標(biāo)志物。同時(shí)也需要更多的研究探討circSLC8A1與其他心臟疾病的關(guān)系。健康個(gè)體及心臟病人血液circRNA表達(dá)譜研究有助于鑒定循環(huán)circRNA標(biāo)志物以用于臨床診斷。

5 結(jié)論

    本研究展示了分化心肌細(xì)胞中豐富表達(dá)的circRNA, 鑒定了許多非基因依賴的circRNAs，也得到許多心臟特異性的circRNAs，包括circSLC8A1, circCACNA1D, circSPHKAP and circALPK2, 這些或可成為分子標(biāo)志物。另外，circSLC8A1的異常表達(dá)與心臟疾病密切相關(guān)。需要更多的研究揭示circRNA在心臟發(fā)育，心血管疾病中作用，并研究病人的血液以鑒定新的circRNA分子標(biāo)志物。

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