Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing maleXenopus laevis chronically exposed to atrazine 

    期刊：Chemosphere   影響因子：4.208分

    發(fā)表單位：山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院

1 摘要

    阿特拉津（Atrazine，簡(jiǎn)稱AZ）是一種外源激素，可影響兩棲動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育。作者以往研究發(fā)現(xiàn)，AZ劑量100ug/L會(huì)引起發(fā)育期雄性蟾蜍發(fā)育異常，引起與性腺相關(guān)基因表達(dá)改變。最近，有人發(fā)現(xiàn)circRNA在多種發(fā)育異常的組織中參與作用。但是否有circRNAs參與AZ處理過(guò)的蟾蜍并不了解。本研究，通過(guò)對(duì)對(duì)照組（n=3）和AZ處理過(guò)的蟾蜍（n=3）的睪丸組織進(jìn)行測(cè)序，鑒定到68575個(gè)circRNAs。AZ處理過(guò)組織中405個(gè)circRNAs表達(dá)有差異，其中44個(gè)上調(diào)，361個(gè)下調(diào)。通過(guò)qPCR對(duì)2個(gè)上調(diào)，6個(gè)下調(diào)的circRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。282差異表達(dá)circRNAs發(fā)揮miRNA海綿吸附作用。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs靶基因主要涉及到19個(gè)pathway，其中Wnt通路， 孕激素介導(dǎo)的卵細(xì)胞成熟通路（progesterone-mediated oocyte maturation）可能是很重要的通路，本研究第一次提供證據(jù)顯示，AZ能夠影響雄性蟾蜍的正常發(fā)育，并能夠調(diào)控睪丸中相關(guān)的基因表達(dá)。

2 研究方法

2.1 樣品準(zhǔn)備

    NF分期47（卵孵化后13d）, 來(lái)源于相同親本，混合性別的蝌蚪，分成不同組，每個(gè)組（n=160），分成8個(gè)小組。AZ用二甲亞砜（DMSO, 0.01%, Sigma, St. Louis., MO, USA）溶解，處理組暴露于AZ（pu rity of 97%, Sigma, St. Louis., MO, USA）180天，對(duì)照組蝌蚪，用0.01% DMSO處理。

按照（Sai et al., 2016）方法，收集發(fā)育中雄性蟾蜍的睪丸，三個(gè)對(duì)照，三個(gè)處理，使用Trizol（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）提取TotalRNA，采用NanoDrop® ND-2000 光譜儀評(píng)估RNA的濃度和純度，變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

2.2 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及circRNA測(cè)序分析

    使用去除核糖體RNA的試劑盒TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit（Illumina, SanDiego, CA, USA） 構(gòu)建文庫(kù)。BioAnalyzer 2100 system （Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）評(píng)估文庫(kù)的質(zhì)量。文庫(kù)解鏈成單鏈DNA分子，測(cè)序儀流動(dòng)槽捕獲測(cè)，PCR反應(yīng)成簇，Illumina HiSeq 4000 進(jìn)行150個(gè)循環(huán)反應(yīng)生成PE150序列。下機(jī)成對(duì)的序列，采用Q30控制質(zhì)量，使用cutadapt軟件去除3’接頭及低質(zhì)量reads。Clean reads將用于circRNAs分析，使用Bowtie2軟件將序列比對(duì)到參考基因組/轉(zhuǎn)錄組（NCBI xl_ref_Xenopus_laevis_v2），使用find_circ軟件鑒定circRNAs。成環(huán)剪切點(diǎn)reads，count值使用整體mapped reads進(jìn)行校正，并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換。t-test進(jìn)行兩組差異表達(dá)分析，fold changes ≥2.0，P-values ≤0.05的circRNAs作為差異表達(dá)的circRNAs.

2.3 靶基因預(yù)測(cè)及生信分析

    使用Targetscan和Miranda 軟件對(duì)circRNAs 結(jié)合miRNA位點(diǎn)，及miRNA靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)差異表達(dá)的circRNAs相關(guān)的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析。

2.4 circRNAs驗(yàn)證

    使用qPCR（Q-RT-PCR, ViiA 7 Real-time PCR System, Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA）對(duì)挑選的8個(gè)circRNA，進(jìn)行驗(yàn)證，totalRNA 用 RNase R酶，消化線性RNA，引物采用divergent primer設(shè)計(jì)如Fig1，circRNAs的選擇參考其潛在的功能和倍數(shù)兩個(gè)因素。qPCR時(shí)，用Invitrogen Superscript cDNA Synthesis kit（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA）將TotalRNA轉(zhuǎn)化成cDNA。RNase R酶處理時(shí)，TotalRNA（2ug）一部分用RNase R（20 U/μl, Epicentre）處理，一部分不用RNase R處理，37 °C 20min，使用2-△△CT法，計(jì)算表達(dá)量。2-△△CT>1時(shí)上調(diào)，2-△△CT<1下調(diào)，基因GPI用于內(nèi)參。qPCR采用三重復(fù)結(jié)果以 mean±standard deviation形式呈現(xiàn)。使用SPSS Statistics 18.0 software（IBM Corp., New York, NY, USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用student t-test at進(jìn)行兩組比較，p<0.05認(rèn)為有差異。

3 研究結(jié)果

3.1 蟾蜍circRNAs鑒定

    對(duì)照組三個(gè)樣品Clean reads分別得到85457078、85154262、70110988條，匹配到參考基因組的reads數(shù)分別是45908497、44827626 、37089055。經(jīng)過(guò)AZ處理的處理組得到的Clean reads數(shù)目是89071634、95827312、84718576，匹配到參考基因組的reads數(shù)目是46499156、52443972、41544671。一共鑒定到68575 個(gè)circRNAs。

3.2 差異表達(dá)分析

處理組與對(duì)照組相比，共有405個(gè)circRNAs表達(dá)有差異，44個(gè)上調(diào)，361個(gè)下調(diào)，火山圖如Fig.2。熱圖展示差異表達(dá)的circRNAs如Fig.3，行代表單個(gè)circRNAs，列代表樣品名字，上面的樹(shù)圖代表樣品聚類，左邊的部分是AZ處理組，右邊是對(duì)照組。本研究原始數(shù)據(jù)存儲(chǔ)在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中，編號(hào)為GSE103526。

3.3 circRNAs的miRNA結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，并構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)

    對(duì)差異表達(dá)的circRNAs進(jìn)行miRNA預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)282個(gè)circRNAs中含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量從1-21不等。對(duì)這282個(gè)circRNAs選取前5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)最多的miRNA, 如Table 4。然后自由選擇了5個(gè)circRNAs，分別是NC_030735.1:109227383-109290634-, NC_030724.1:105611901-105637401+, NC_030734.1:106398702-106449286+, NW_016694872.1:550852-632532-, NC_030735.1:34874500-34913276-。構(gòu)建circRNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)。如 fig4。

3.4 circRNA相關(guān)靶基因KEGG富集分析

    基于circRNAs相關(guān)的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)19個(gè)信號(hào)通路，Table3, 其中，enrichment score排序發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路排在最前，并包含21個(gè)miRNAs靶基因，Wnt通路圖如Fig.5。前十個(gè)通路展示如Fig.6。

3.5 circRNA驗(yàn)證

    對(duì)8個(gè)circRNAs進(jìn)行qPCR發(fā)現(xiàn)，2個(gè)circRNAs是上調(diào)的（NC_030738.1:39776310-39778799- 和NC_030738.1:21126033-21131815+），6個(gè)circRNAs是下調(diào)的（NC_030734.1:102788414-102788574-, NW_016694872.1:550852-632532-,

NC_030737.1:31865134-31952348-, NC_030735.1:109227383-109290634-, NC_030734.1:106398702-106449286 + and NC_030732.1:43721272-43728946-;）qPCR驗(yàn)證的結(jié)果與circRNA測(cè)序的結(jié)果趨勢(shì)一致。RNase R酶消化實(shí)驗(yàn)顯示，這些RNA確是環(huán)狀的。如圖Fig7.

4 討論

    AZ是一個(gè)常用的除草劑，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)有一定的危害。暴露在AZ的環(huán)境，可能是兩棲動(dòng)物種群數(shù)量下降的一個(gè)重要原因，AZ能夠影響他們的生長(zhǎng)，代謝，免疫系統(tǒng)以及血細(xì)胞過(guò)程（Langerveld et al., 2009）。我們之前的研究顯示AZ的毒性與蟾蜍基因水平的改變相關(guān)。AZ對(duì)蟾蜍的生存產(chǎn)生影響，而且睪丸的體重和性腺指數(shù)均顯著下降。另外，AZ的不同劑量（0.01, 1, 10, 100μg/L）均會(huì)引起睪丸的退化，尤其是發(fā)育期的小蟾蜍暴露在100μg/L時(shí)。結(jié)果表明AZ通過(guò)干擾相關(guān)基因的表達(dá)量改變，影響雄性發(fā)育期蟾蜍的生殖能力和免疫系統(tǒng)。此結(jié)果也促使我們?nèi)パ芯科浔澈蟾嗟臐撛诜肿訖C(jī)制。本研究，我們用qPCR驗(yàn)證了RNase R酶處理下，circRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示我們的方法有效的鑒定到了蟾蜍睪丸中circRNAs的種類。circRNAs是一類近些年發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，并受到廣泛關(guān)注。circRNAs表達(dá)豐富，穩(wěn)定，并且進(jìn)化保守(筆者對(duì)circRNAs基因組來(lái)源序列多物種保守性分析發(fā)現(xiàn)確實(shí)很保守，circRNA大多來(lái)源于外顯子剪切形成，外顯子是基因編碼區(qū)，不同物種間保守程度很高)，在胞內(nèi)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和表觀遺傳中通過(guò)吸附miRNAs起重要的調(diào)控作用。Memczak et al. 發(fā)現(xiàn)，circRNAs在不同的組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)不同。自從基于對(duì)基因組測(cè)序的方式發(fā)現(xiàn)circRNAs以來(lái), 大量的circRNAs被報(bào)道出來(lái)，包括人，古細(xì)菌，線蟲，小鼠等（Salzman et al., 2012; Danan et al., 2012; Memczak et al., 2013）。但，在兩棲動(dòng)物中還沒(méi)有通過(guò)RNAseq技術(shù)報(bào)道過(guò)circRNAs，本研究，通過(guò)RNAseq，我們發(fā)現(xiàn)了68575個(gè)circRNAs。之前沒(méi)有關(guān)于AZ處理蟾蜍睪丸組織中circRNAs的數(shù)據(jù)。本研究第一次提供證據(jù)，表明circRNAs在受到AZ處理的蟾蜍睪丸組織中有差異表達(dá)。之前有報(bào)道稱circRNAs的表達(dá)量變化與疾病的發(fā)生有關(guān)（Lin et al., 2016），因而，我們可以推斷，circRNAs的改變與蟾蜍睪丸退化有關(guān)。

    Hansen et al. 報(bào)道circRNAs的吸附作用是一個(gè)普通的現(xiàn)象。circRNAs通過(guò)與miRNAs的結(jié)合，調(diào)控miRNAs的靶基因。我們發(fā)現(xiàn)405個(gè)差異表達(dá)的circRNAs中有282個(gè)circRNAs有miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，數(shù)量1-21個(gè)不等。蟾蜍中circRNAs作為miRNAs海綿吸附作用與之前在人、雞、小麥等物種中報(bào)道的類似（Memczak et al., 2013; Zhang et al., 2016; Wang et al., 2016）。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)量改變?cè)贏Z處理的蟾蜍睪丸退化中發(fā)揮重要作用。因此，我們推斷這些改變的circRNAs通過(guò)miRNA海綿吸附作用，阻止miRNAs與其調(diào)控的靶基因結(jié)合，進(jìn)而在發(fā)育異常組織中發(fā)揮作用。

    我們進(jìn)一步分析了circRNAs的靶基因的功能，在KEGG通路中共注釋到19個(gè)顯著的通路，并發(fā)現(xiàn)在Wnt通路中有21個(gè)靶基因（mRNA）.Wnt通路會(huì)受到胞內(nèi)多種信號(hào)分子的調(diào)控，進(jìn)而引起多種細(xì)胞響應(yīng)，包括基因轉(zhuǎn)錄，增殖，分化，遷移等（Kikuchi et al., 2009; Grumolato et al., 2010; Simons et al., 2012），Wnt通路的精確調(diào)控在正常發(fā)育和組織維持中是極其重要的（Schneider et al., Rudloff and Kemler, 2012）。因而，我們推測(cè)，AZ處理的蟾蜍睪丸退化中，與Wnt信號(hào)通路相關(guān)的差異circRNAs起到了很重要的作用。以往研究，在差異表達(dá)的基因中我們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)信號(hào)通路。孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟信號(hào)通路（Progesterone-mediated oocyte maturation pathway）就是其中一個(gè)。有趣的是，此通路在本研究中也被鑒定到。因而我們推斷，該通路也與AZ處理蟾蜍睪丸異常發(fā)育有關(guān)。這些數(shù)據(jù)同樣給出了一個(gè)啟示，差異表達(dá)的circRNAs可能可以作為新的雄性生殖毒理的分子標(biāo)志物。而且，本研究為進(jìn)一步研究AZ處理蟾蜍睪丸退化中circRNA調(diào)控分子機(jī)制，提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。并且，本研究有助于我們理解circRNAs的一般功能，以及在環(huán)境如AZ響應(yīng)中的作用。

5 結(jié)論

    本研究，在蟾蜍睪丸組織中鑒定到68575個(gè)circRNAs。 circRNAs的表達(dá)譜顯示circRNA的表達(dá)量改變與睪丸生殖毒理密切相關(guān)。405個(gè)circRNAs差異表達(dá)，其中44個(gè)上調(diào)，361個(gè)下調(diào)。282個(gè)差異表達(dá)的circRNAs發(fā)揮了miRNA海綿吸附作用。KEGG通路顯示，這些circRNAs主要涉及到19個(gè)通路，其中Wnt通路，Progesterone-mediated oocyte maturation通路是兩個(gè)非常重要 的通路。我們的研究有助于理解，AZ處理的雄性蟾蜍生殖毒理中潛在的的分子機(jī)制。

本研究思路簡(jiǎn)要整理：

    研究目的：雄性蟾蜍睪丸退化中circRNAs是否參與該過(guò)程

    實(shí)驗(yàn)方法：

    材料：AZ處理的發(fā)育期雄性蟾蜍睪丸及未經(jīng)AZ處理的對(duì)照，測(cè)序樣品為3對(duì)3設(shè)計(jì)。

    RNAseq測(cè)序策略：做circRNA測(cè)序通常有兩種建庫(kù)方式，一種是去核糖體rRNA，RNase R去線性RNA，鏈特異性建庫(kù)的方式；另一種是去核糖體rRNA, 不去線性RNA，而對(duì)所有長(zhǎng)鏈RNA，進(jìn)行鏈特異性建庫(kù)的方式。本研究采用第二種方式，沒(méi)有去處線性RNA。采用HiSeq 4000上機(jī)，PE150測(cè)序模式。

    circRNA差異分析：先使用find_circ對(duì)clean reads進(jìn)行處理，獲得circRNA count值，再對(duì)count值，使用total mapped reads進(jìn)行校正，并做log2轉(zhuǎn)換。然后使用t-test方法進(jìn)行差異分析。fold changes ≥2.0，P-values ≤0.05的circRNAs作為差異表達(dá)的 circRNAs.

    海綿吸附作用miRNA預(yù)測(cè)：使用Targetscan 和Miranda 軟件預(yù)測(cè)circRNA結(jié)合的miRNA（沒(méi)有miRNA的表達(dá)量數(shù)據(jù)，此miRNA會(huì)用該物種所有miRNA進(jìn)行掃描），由于一個(gè)circRNA可能會(huì)與幾十，幾百個(gè)miRNA結(jié)合，此處選擇前5個(gè)結(jié)合位點(diǎn)最多的miRNA，作為circRNA的結(jié)合miRNA（此處確定miRNA的目的是為了進(jìn)行構(gòu)建，circ-miRNA網(wǎng)絡(luò)及miRNA靶基因預(yù)測(cè)）。

    靶基因富集分析：circRNA-associated target genes富集，通常有兩類，一是circRNA的來(lái)源基因，另一類是circRNA 結(jié)合的miRNA，miRNA的靶基因。作者對(duì)circRNA潛在結(jié)合的miRNA進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并做了miRNA 的靶基因預(yù)測(cè)。KEGG分析，基于miRNA的靶基因。

    circRNA qPCR驗(yàn)證：挑選8個(gè)進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，采用RNase R處理的和沒(méi)有處理的兩種方式。405個(gè)有差異的，circRNA選擇哪些呢，作者考慮circRNA的表達(dá)量變化差異（差異比較大），及circRNA的重要性（此處考慮circRNA 結(jié)合miRNAs進(jìn)而調(diào)控的重要基因，選擇重要的circRNA）。

    文章結(jié)果展示： 

    1. 對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)clean reads及mapped reads進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。

    2. 差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)描述，并用火山圖和熱圖展示。

    3. Circ-miRNA結(jié)合，選取了5個(gè)circRNA（可以結(jié)合miRNA的circRNA有282個(gè)，如果都用，這個(gè)網(wǎng)會(huì)非常的大），構(gòu)建circ-miRNA網(wǎng)絡(luò)。

    4. KEGG對(duì)circRNA 結(jié)合miRNA 的靶基因進(jìn)行富集分析，富集到19個(gè)通路，附件表格列出19個(gè)通路的信息，正文用散點(diǎn)圖展示top10個(gè)通路，作者重點(diǎn)關(guān)注 Wnt通路，并在文中放了Wnt通路圖，標(biāo)注顏色為miRNA的靶基因。

    5. circRNA的驗(yàn)證，qPCR. 用柱狀圖說(shuō)明，circRNA鑒定的準(zhǔn)確性。

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