Circular RNA mediates cardiomyocyte death via miRNA-dependent upregulation of MTP18 expression

circRNA通過依賴于miRNA上調(diào)的MTP18表達(dá)介導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡

    期刊：cell death and differentiation；影響因子：8.00

    發(fā)表單位：青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所

    circRNA MFACR作為miR-652-3p的海綿，調(diào)節(jié)MTP18的表達(dá)來介導(dǎo)心肌死亡。

    在這里，我們顯示circRNA MFACR通過直接靶向和下調(diào)miR-652-3p調(diào)節(jié)心臟中的線粒體裂變和細(xì)胞凋亡；這反過來通過抑制MTP18翻譯來阻斷線粒體分裂、心肌細(xì)胞死亡和心肌梗死（MI）。我們的研究結(jié)果揭示了MFACR/miR-652-3p/MTP18軸作為心臟細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)劑將是治療心血管疾病的潛在治療靶標(biāo)。

    據(jù)報(bào)道，CircRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥中具有重要作用，包括結(jié)腸直腸癌和胰腺導(dǎo)管腺癌。因此，circRNA可以作為疾病的新診斷和治療策略。在正常組織中和在腫瘤樣品中的環(huán)狀RNA同種型的比例之間也存在差異，這表明circRNA可以用作人類疾病的診斷或預(yù)測生物標(biāo)志物。然而，circRNA在心肌細(xì)胞中的功能仍然未知。我們的研究首次揭示了circRNA可調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)，心肌細(xì)胞凋亡和MI。

    將培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧/再氧合（A/R），在A/R條件下，心肌細(xì)胞中MTP18的水平顯著升高，伴隨著線粒體分裂和細(xì)胞凋亡的顯著增加。接下來，我們使用MTP18 siRNA來檢測MTP18在A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡中的影響，MTP18的抑制顯著減少了具有片段化線粒體的細(xì)胞數(shù)量，MTP18的敲低減弱了A/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其顯示通過胱天蛋白酶-3活性的顯著降低和末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）陽性細(xì)胞的數(shù)量減少。接下來，我們使用MI的小鼠I/R損傷模型驗(yàn)證了以上結(jié)果。這些結(jié)果表明MTP18在氧剝奪應(yīng)激期間參與線粒體裂變介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡。

    首先篩選了培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中一些已知miRNA的表達(dá)水平，在A/R下心肌細(xì)胞中miR-652-3p水平顯著下調(diào)，其他miRNA的水平保持不變。使用RNAhybrid程序的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MTP18的3'-UTR具有miR-652-3p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，有趣的是，miR-652-3p的表達(dá)不影響MTP18 mRNA的水平。相反，使用antagomir抑制miR-652-3p增加了MTP18蛋白的水平。此外，miR-652-3p的強(qiáng)制表達(dá)減弱了A/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中MTP18蛋白水平的增加。然后使用熒光素酶測定系統(tǒng)，研究表明miR-652-3p靶向MTP18的3'-UTR以阻止其翻譯，MTP18是miR-652-3p的下游靶標(biāo)。

    在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，miR-652-3p的強(qiáng)制表達(dá)減弱了A/R誘導(dǎo)的線粒體分裂和細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)表明miR-652-3p充當(dāng)負(fù)調(diào)節(jié)因子并抑制心肌細(xì)胞中的線粒體分裂和凋亡。類似地，具有I/R（缺血/再灌注）損傷的小鼠的心臟組織中，通過遞送miR-652-3p模擬物增強(qiáng)miR-652-3p水平顯著降低了I/R損傷的心臟組織中的MTP18表達(dá)，其伴隨著片段化線粒體和凋亡細(xì)胞的減少。隨后使用了靶保護(hù)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR-652-3p在MTP18靶保護(hù)劑存在下不抑制線粒體裂變和細(xì)胞凋亡，這表明miR-652-3p直接與MTP18相互作用。總之，這些結(jié)果證實(shí)miR-652-3p直接靶向MTP18以抑制線粒體裂變和細(xì)胞凋亡。

    為了確定負(fù)責(zé)A/R誘導(dǎo)的miR-652-3p抑制上調(diào)的circRNA，我們從circRNA在線數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)篩選了circRNAs。然后，我們使用引物評(píng)估其表達(dá)，qRT-PCR結(jié)果顯示mm9-circ-016597的顯著增加，我們將其命名為MFACR。使用RNAhybrid生物信息學(xué)程序分析發(fā)現(xiàn)MFACR在miR-652-3p上含有15個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。使用生物素偶聯(lián)的miR-652-3p模擬物（Bio-652-3p-wt）及其突變體（Bio-652-3p-mut）進(jìn)行RNA pull-down測定證實(shí)MFACR與miR-652-3p的相互作用。接下來，我們使用生物素標(biāo)記的MFACR探針進(jìn)行反向下拉測定，并評(píng)估miR-652-3p的水平。miR-652-3p的northern印跡分析清楚地檢測到MFACR與miR-652-3p的結(jié)合，這些數(shù)據(jù)表明MFACR可以在體內(nèi)直接結(jié)合miR-652-3p。

    用基于載體的系統(tǒng)過表達(dá)MFACR，MFACR-ir用作陰性對照。通過RNA印跡和qRT-PCR分析構(gòu)建體的效率。然后我們分析了MFACR是否調(diào)節(jié)MTP18的表達(dá)和活性。使用具有MFACR構(gòu)建體的腺病毒過表達(dá)MFACR增強(qiáng)了心肌細(xì)胞中的MTP18水平，而用siRNA敲除MFACR顯著抑制MFACR表達(dá)。此外，MFACR拮抗miR-652-3p對MTP18表達(dá)水平和活性的抑制。上述結(jié)果表明MFACR作為miR-652-3p海綿起作用，調(diào)節(jié)MTP18在心肌細(xì)胞中的表達(dá)和活性。

    在培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，MFACR表達(dá)的沉默減弱了由A/R誘導(dǎo)的線粒體斷裂和凋亡。在小鼠中，MFACR的敲低促進(jìn)miR-652-3p表達(dá)并且在I/R損傷中降低心臟中的MTP18蛋白，減弱了I/R誘導(dǎo)的線粒體分裂的上調(diào)，細(xì)胞凋亡和MI大小。這些數(shù)據(jù)表明MFACR有助于促進(jìn)參與線粒體裂變和心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡的信號(hào)傳導(dǎo)。用miR-652-3p和/或MFACR的拮抗劑共轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞證實(shí)了MTP18是MFACR/miR-652-3p/MTP18信號(hào)軸的下游。

    本研究證實(shí)了MTP18的調(diào)節(jié)機(jī)制及其在缺血性心臟病中的致病作用。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)circRNA MFACR，miR-652-3p和MTP18共同構(gòu)成調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞線粒體裂變和細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。這為了解線粒體裂變相關(guān)的分子事件提供了新的線索，揭示了由心肌細(xì)胞異常線粒體分裂引發(fā)的凋亡細(xì)胞死亡的復(fù)雜分子機(jī)制。

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