Synthetic Circular RNA Functions as a miR-21 Sponge to Suppress Gastric Carcinoma Cell Proliferation

合成環(huán)狀RNA作為miR-21海綿抑制胃癌細(xì)胞增殖

    期刊：Molecular Therapy-Nucleic Acids；影響因子：5.660

    發(fā)表單位：西安交通大學(xué)

    合成circRNA可以作為miR-21海綿抑制胃癌的進(jìn)展。

    我們假設(shè)合成的circRNA海綿可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)特定miR的治療性功能喪失。然后經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得出，可以使用簡(jiǎn)單的酶促連接步驟合成對(duì)核酸酶消化具有抗性的人工circRNA海綿。這些海綿抑制癌細(xì)胞增殖并抑制miR-21對(duì)下游蛋白質(zhì)靶標(biāo)的活性?？傊?，合成的circRNA海綿代表了一種簡(jiǎn)單，有效，方便的策略，用于在體外實(shí)現(xiàn)miR功能的靶向喪失，并且在人類患者中具有潛在的未來(lái)治療應(yīng)用。.

    胃癌（GC）仍然是全球第五大常見癌癥，也是癌癥死亡的第三大原因。大多數(shù)GC病例在晚期診斷，結(jié)果不良，治療效果受到很大限制。進(jìn)行細(xì)胞毒性化療。幸運(yùn)的是，隨著我們對(duì)胃分子癌發(fā)生的深入理解，目前正在發(fā)現(xiàn)基于分子靶向治療的2種新的潛在治療策略。

    基于來(lái)自癌癥基因組圖譜（TCGA）中的446個(gè)GC和45個(gè)正常樣品的miR序列數(shù)據(jù)，鑒定了185個(gè)異常表達(dá)的miR，其中137個(gè)上調(diào)，48個(gè)下調(diào)。miR-21，我們感興趣的miR，在GC中比正常樣品上調(diào)1.76倍。

    使用TaqMan qRT-PCR分析，相對(duì)于正常胃上皮細(xì)胞系HFE145，我們發(fā)現(xiàn)miR-21在NCI-N87、KATOIII、AGS、MKN28中顯著過(guò)表達(dá)。我們選擇NCI-N87，AGS和MKN28進(jìn)行后續(xù)研究，因?yàn)閙iR-21的表達(dá)水平高于KATOIII細(xì)胞。

    我們的體外RNA環(huán)化策略使用含有5個(gè)重復(fù)miR凸起結(jié)合位點(diǎn)的合成線性RNA的酶促連接。通過(guò)RT-PCR和Sanger測(cè)序驗(yàn)證了circRNA海綿的精確構(gòu)建。RT-PCR結(jié)果證實(shí)，不同引物僅從環(huán)狀（scRNA21）模板RNA產(chǎn)生預(yù)期的100-nt產(chǎn)物，而不是從相應(yīng)的線性（LRNA21）模板RNA產(chǎn)生。相反，會(huì)聚引物從圓形和線性RNA模板產(chǎn)生預(yù)期產(chǎn)物。此外，頭部到尾部的circRNA連接點(diǎn)僅在scRNA21產(chǎn)生的不同PCR產(chǎn)物中得到驗(yàn)證。在由LRNA21和scRNA21海綿產(chǎn)生的會(huì)聚PCR產(chǎn)物中驗(yàn)證了五個(gè)重復(fù)的miR-21凸起（錯(cuò)配）結(jié)合位點(diǎn)。在陰性對(duì)照雜亂的circRNA中也證實(shí)了頭對(duì)尾連接和五個(gè)重復(fù)的雜亂位點(diǎn)。

    將核酸酶介導(dǎo)的scRNA21海綿降解的抗性與其線性對(duì)應(yīng)物LRNA21的抗性進(jìn)行比較，首先使用胎牛血清（FBS）介導(dǎo)的降解。30分鐘后，LRNA21在4％FBS中降解92％。相反，scRNA21顯著更穩(wěn)定，30分鐘后僅降低9％。事實(shí)上，scRNA21僅在FBS中以7％或更高的濃度降解。然后在用特異性外切核酸酶RNase R消化后比較環(huán)狀和線性RNA的穩(wěn)定性。LRNA21分別用1或3U RNase R/1μgRNA降解94％或97％；相反，scRNA21僅降低9％或14％。

    在共轉(zhuǎn)染后24小時(shí)測(cè)定NCI-N87，AGS和MKN28 GC細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)在所有三種細(xì)胞系中觀察到降低的標(biāo)準(zhǔn)化螢火蟲熒光素酶活性。當(dāng)含有多個(gè)miR-21結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與常規(guī)線性miR-21抑制劑共轉(zhuǎn)染時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性恢復(fù)。值得注意的是，當(dāng)用我們的scRNA21共轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，觀察到甚至更大的熒光素酶活性恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了scRNA21作為miR-21海綿的功能有效性。隨后通過(guò)WST-1測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著降低的細(xì)胞增殖與顯著增加的細(xì)胞凋亡。

    使用Tandem Mass Tag（TMT）標(biāo)記進(jìn)行泛蛋白質(zhì)組學(xué)篩選得到6,314個(gè)單獨(dú)蛋白質(zhì)的列表。根據(jù)Ingenuity Pathway Analysis的目標(biāo)預(yù)測(cè)，其中的235種代表了miR-21的推定的直接結(jié)合靶。235種蛋白中的19種增加了倍數(shù)變化。在scRNA21處理后，這些預(yù)測(cè)的直接miR-21靶標(biāo)的蛋白質(zhì)水平（其應(yīng)被miR-21下調(diào)）恢復(fù)。在COSMIC共識(shí)癌基因列表中發(fā)現(xiàn)了這19種死亡域相關(guān)腫瘤抑制蛋白DAXX中只有1種。然后使用抗DAXX抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)在scRNA轉(zhuǎn)染兩種GC細(xì)胞系NCI-N87和AGS后8小時(shí)恢復(fù)DAXX蛋白水平。這些數(shù)據(jù)證明了scRNA21針對(duì)特定miR-21下游靶腫瘤抑制基因的功能活性。

    在未來(lái)的研究中，我們將確認(rèn)scRNA21對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響，研究scRNA21活性的潛在機(jī)制，并評(píng)估動(dòng)物模型中的scRNA21毒性。盡管有這些潛在的缺陷，并考慮到oncomiRs在腫瘤發(fā)生和腫瘤進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，據(jù)我們所知，這些結(jié)果首次揭示了合成circRNA海綿作為抗癌研究和未來(lái)分子療法的新工具的巨大前景。

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