A peptide encoded by circular form of LINC-PINT suppresses oncogenic transcriptional elongation in glioblastoma

由環(huán)狀LINC-PINT編碼的肽抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的致癌轉(zhuǎn)錄延伸

    期刊：Nat Commun；影響因子：12.353

    發(fā)表單位：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院

    之前介紹了circRNA作為海綿吸附miRNA發(fā)揮作用，本研究發(fā)現(xiàn)circRNA序列中包含一個進(jìn)化上高度保守的開放閱讀框，通過內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)序列IRES驅(qū)動翻譯一個由87個氨基酸組成的肽。研究發(fā)現(xiàn)PINT87aa通過結(jié)合聚合酶相關(guān)因子復(fù)合物基因PAF1，抑制多種癌基因的轉(zhuǎn)錄延伸，進(jìn)而抑制惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展。

    在這里，我們證明由長鏈非編碼RNA產(chǎn)生的內(nèi)源性circRNA編碼調(diào)節(jié)肽。通過核糖體新生鏈復(fù)合物結(jié)合的RNA測序（RNC-seq），我們發(fā)現(xiàn)了幾種可能由circRNA編碼的肽。我們鑒定了由長基因間非蛋白質(zhì)編碼RNA p53誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物（LINC-PINT）的環(huán)形形式編碼的87-氨基酸肽，其在體外和體內(nèi)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖。

    迄今為止，circRNA通常被認(rèn)為是非編碼RNA（ncRNA）。然而，最近的證據(jù)表明功能性肽由ncRNA中的短開放閱讀框（sORF）編碼。另外，某些合成的circRNA是可翻譯的，這提出了在哺乳動物細(xì)胞中含有sORF的天然circRNA是否被翻譯成蛋白質(zhì)或肽的問題。

    使用核糖體RNA耗盡的總RNA和來自正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHA）和U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的RNC-RNA來生成circRNAs（轉(zhuǎn)錄組測序）和RNC-RNAs（translatome測序）的RNA-seq數(shù)據(jù)庫。通過測序并對差異表達(dá)的circRNA的宿主基因進(jìn)行GO富集分析，并且該基因集富集用于GO分子功能，包括蛋白質(zhì)結(jié)合和細(xì)胞成分組織。大多數(shù)circRNA與其宿主蛋白編碼基因共享相同的CDS。共發(fā)現(xiàn)10個非編碼宿主基因，其中5個具有編碼潛能。初步篩選LINC-PINT進(jìn)行進(jìn)一步研究。LINC-PINT是一種抑制腫瘤的長基因間非編碼RNA（lincRNA），參與Polycomb抑制復(fù)合物2（PRC2）。

    RNC-RNA組中有15個反拼接點(diǎn)特異性reads，而總RNA組中有7個reads，這意味著LINC-PINT的外顯子2被鑒定為可翻譯的環(huán)狀RNA。LINC-PINT的長外顯子2含有3'AG受體和反向剪接所需的5'GT供體序列，被鑒定為人CircBase中的circRNA（具有circ-0082389）。通過在逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（q-PCR）和Sanger測序分析來自不同引物的PCR產(chǎn)物，以顯示環(huán)狀LINC-PINT外顯子2的連接。然后用專門設(shè)計(jì)用于檢測環(huán)狀連接或線性連接的引物/探針進(jìn)行Q-PCR和熒光原位雜交（FISH）分析，證實(shí)了人細(xì)胞系中LINC-PINT外顯子2的頭對尾拼接環(huán)形式的存在。LINC-PINT和circPINTexon2呈現(xiàn)不同的細(xì)胞定位：線性LINC-PINT主要定位于細(xì)胞核，而circPINTexon2主要是細(xì)胞質(zhì)。

    我們首先分析了LINC-PINT外顯子2中的所有潛在的sORF。我們鑒定了兩個sORF，可能編碼長度為69aa和87aa的肽，在這個外顯子中，在多個物種中高度保守。并通過免疫熒光測試驗(yàn)證了編碼87-aa肽的第二個sORF的表達(dá)。利用生物信息學(xué)分析和IRES活性測試證明了circPINTexon2含有天然內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）的活性。通過構(gòu)建環(huán)狀RNA表達(dá)質(zhì)粒以及制備特異性抗體結(jié)合蛋白質(zhì)譜證實(shí)環(huán)狀RNA circ-PINT通過內(nèi)部核糖體插入位點(diǎn)序列IRES驅(qū)動翻譯一個由87個氨基酸組成的全新多肽PINT87aa。

    使用RFP融合蛋白標(biāo)記，我們發(fā)現(xiàn)該肽集中在細(xì)胞核中。我們建立穩(wěn)定過表達(dá)線性PINT87aa-GFP載體或環(huán)狀circPINTexon2載體的456和4121細(xì)胞。另外，我們生成了CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的PINT87aa K.O. SW1783和Hs683細(xì)胞。與相應(yīng)的對照細(xì)胞相比，過表達(dá)線性PINT87aa和circPINTexon2的456和4121細(xì)胞均表現(xiàn)出G1停滯和細(xì)胞增殖減少而沒有明顯的細(xì)胞毒性，而PINT87aa K.O. SW1783和Hs683細(xì)胞顯示出增加的細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖速率。過表達(dá)線性和環(huán)狀載體的456-PINT87aa和4121-PINT87aa細(xì)胞顯示出顯著的生長減少，而PINT87aa K.O. SW1783和Hs683細(xì)胞在平板菌落和軟瓊脂中顯示增強(qiáng)的細(xì)胞增殖和惡性表型。基于上述結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)circPINTexon2通過PINT87aa代替circPINTexon2發(fā)揮其腫瘤抑制功能。

    使用抗Flag抗體對用PINT87aa-3XFlag轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞和相應(yīng)的對照細(xì)胞進(jìn)行免疫沉淀。對沉淀物進(jìn)行LC-MS/MS發(fā)現(xiàn)PINT87aa可能與PAF1蛋白復(fù)合物結(jié)合。通過分子模擬及coIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)了87aa可以和PAF1結(jié)合。此外，GFP-PINT87aa和PAF1共定位于細(xì)胞核中，表明PINT87aa可能參與PAF1靶基因調(diào)控。我們在PINT87aa過表達(dá)456和4121細(xì)胞中進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，以確定PINT87aa是否參與PAF1靶基因延伸。與對照細(xì)胞相比，過表達(dá)PIN87aa的456和4121細(xì)胞中PAF1下游基因的mRNA被轉(zhuǎn)錄抑制。在PINT87aa K.O. Hs683和SW1783細(xì)胞，這些基因的表達(dá)在mRNA和蛋白質(zhì)水平均增加。

    CircPINTexon2和PINT87aa在腫瘤相鄰的正常腦組織中表達(dá)，但在所有腦腫瘤組織中表達(dá)降低，類似于LINC-PINT，其表達(dá)水平在乳腺癌，肝細(xì)胞癌和胃癌中亦是如此。在動物模型中，與對照細(xì)胞相比，在線性或環(huán)狀質(zhì)粒上穩(wěn)定過表達(dá)PINT87aa的456和4121細(xì)胞表現(xiàn)出降低的原位致瘤潛力。此外，將Hs683和SW1783 PINT87aa K.O.細(xì)胞和對照細(xì)胞皮下注射到裸鼠中，隨后用卡尺和體內(nèi)熒光成像監(jiān)測腫瘤生長。與其親代細(xì)胞相比，PINT87aa K.O.細(xì)胞導(dǎo)致異種移植腫瘤體積顯著增加，進(jìn)一步支持PINT87aa肽在體內(nèi)的抗癌作用。

    迄今為止，尚未報(bào)道由長ncRNA產(chǎn)生的編碼circRNA。我們發(fā)現(xiàn)由circRNA編碼的肽及其對人類惡性腫瘤的調(diào)節(jié)作用表明，circRNA可能發(fā)揮比先前預(yù)測的更多的生物學(xué)功能。circRNA編碼的肽調(diào)節(jié)人類癌癥行為，可能具有重要的臨床意義和應(yīng)用。此外，我們的結(jié)果提供了關(guān)于circRNA和長ncRNA的新觀點(diǎn)，其生物學(xué)功能尚未顯露。

    上海生因生物專業(yè)提供基因組測序、微生物測序、轉(zhuǎn)錄組測序（RNAseq），高通量測序數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分析、個性化分析，各類圖表繪制，及GEO、TCGA數(shù)據(jù)挖掘服務(wù)。有需要的聯(lián)系我們。

其他相關(guān)文獻(xiàn)解讀

文獻(xiàn)解讀：從miRNA入手尋找ceRNA機(jī)制分子circRNA（二）

文獻(xiàn)解讀：從miRNA入手尋找ceRNA機(jī)制分子circ/lncRNA

文獻(xiàn)解讀：首次：體外合成circRNA海綿吸附miRNA治療癌癥

文獻(xiàn)解讀：circRNA-蛋白質(zhì)相互作用介紹

文獻(xiàn)解讀：circRNA過表達(dá)可以抑制HCC（ceRNA機(jī)制）

文獻(xiàn)解讀：讀文獻(xiàn)學(xué)RNAseq-GO分析應(yīng)用1

文獻(xiàn)解讀：circRNA過表達(dá)可以導(dǎo)致心肌死亡（ceRNA機(jī)制）

文獻(xiàn)解讀：circRNA不研究機(jī)制也可以發(fā)到9分？