Non-coding effects of circular RNA CCDC66 promote colon cancer growth and metastasis

circRNA CCDC66的非編碼效應(yīng)促進(jìn)結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移

期刊：Cancer Res.；影響因子：9.130

發(fā)表單位：國立成功大學(xué)

    circRNA可用作miRNA海綿促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。

    在這里，我們描述了新型circRNA，circCCDC66在結(jié)直腸癌（CRC）中的功能作用。來自匹配的正常和腫瘤結(jié)腸組織樣品的RNA-Seq數(shù)據(jù)鑒定了癌細(xì)胞中特異性升高的多種circRNA，其中幾種通過定量RT-PCR驗(yàn)證。CRC細(xì)胞系中的功能獲得和功能喪失研究表明，circCCDC66控制多種病理過程，包括細(xì)胞增殖，遷移，侵襲和不依賴貼壁的生長，其表達(dá)在息肉和結(jié)腸癌中升高，并且與預(yù)后不良有關(guān)。深入表征顯示circCCDC66通過調(diào)節(jié)癌基因的子集發(fā)揮其功能，并且circCCDC66的敲低分別抑制異種移植和原位小鼠模型中的腫瘤生長和癌癥侵襲?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了circRNA在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的新的致癌功能。

    結(jié)直腸癌是第三大常見癌癥，2012年新發(fā)病例約為140萬，并且在美國被列為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管進(jìn)行了深入研究和治療改進(jìn)，但超過50％的結(jié)腸癌患者最終死于這種疾病，這凸顯了解開導(dǎo)致結(jié)腸癌惡性腫瘤的其他未知機(jī)制的必要性。在此，我們的目的是鑒定與結(jié)腸直腸癌臨床相關(guān)的circRNA，并研究這些circRNA在結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用。

    我們采取了一個(gè)有效的方法，篩選了74個(gè)環(huán)狀RNA。然后選擇了源自CCDC66的circRNA，因?yàn)闆]有與其親本基因相關(guān)的已知功能。來自多個(gè)細(xì)胞系的RT-PCR結(jié)果證明circCCDC66在除了正常細(xì)胞外所有測(cè)試的結(jié)腸直腸，乳腺，胰腺和宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)，表明circCCDC66水平升高可能是這些癌癥的腫瘤發(fā)生的一般原因。細(xì)胞定位分析顯示，circRNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，這種現(xiàn)象與外顯子circRNA的特性一致。通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，癌細(xì)胞中線性CCDC66的水平較低。在用缺氧處理的癌細(xì)胞中線性CCDC66轉(zhuǎn)錄物的水平顯著降低，而環(huán)狀CCDC66轉(zhuǎn)錄物的水平保持不變。這說明瘤內(nèi)的缺氧應(yīng)激能促進(jìn)circCCDC66積累循環(huán)，并且由于自身的穩(wěn)定性能加強(qiáng)這種積累作用。臨床發(fā)現(xiàn)circCCDC66在癌前息肉組織中高表達(dá)，且在腫瘤組織中的水平更高。在不同分期內(nèi)，其在腫瘤中的水平都是高于癌旁組織。結(jié)合生存曲線，發(fā)現(xiàn)circCCDC66與不良預(yù)后相關(guān)，并且其表達(dá)水平是CRC檢測(cè)和預(yù)后的良好預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。

    我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種siRNA寡核苷酸以靶向獨(dú)特的后裂解連接，特異性敲低circCCDC66，但不影響線性CCDC66 mRNA的水平。特異性敲低導(dǎo)致HCT116和HT-29中的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，其通過抑制細(xì)胞增殖介導(dǎo)，但不通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外circCCDC66的敲低顯著減少了細(xì)胞遷移、和侵襲。隨后我們使用pCIRC2（circRNA表達(dá)載體）來過表達(dá)circCCDC66，如通過RT-PCR和Sanger測(cè)序所證實(shí)的。circCCDC66的過表達(dá)顯著增加了軟瓊脂中細(xì)胞集落的數(shù)量。此外，BrdU摻入測(cè)定顯示過表達(dá)circCCDC66刺激DNA合成。

    我們使用CCDC66外顯子8至10進(jìn)行了miRNA靶序列分析，分析顯示該區(qū)域可能被99個(gè)miRNA靶向。根據(jù)三項(xiàng)獨(dú)立的全基因組研究GSE63119，GSE46622和GSE43793，在這99種miRNA中，62種在結(jié)腸直腸癌組織中表達(dá)。通過分析結(jié)直腸癌中有顯著差異表達(dá)的癌基因及腫瘤抑制基因，37.5％的致癌基因具有CRC表達(dá)的miRNA的靶向位點(diǎn)，而僅有23.5％的腫瘤抑制基因含有這樣的位點(diǎn)。我們使用過表達(dá)和敲除方法操縱circCCDC66的水平，發(fā)現(xiàn)作為預(yù)測(cè)的miRNA的靶標(biāo)的DNMT3B，EZH2，MYC和YAP1的水平被circCCDC66過表達(dá)顯著上調(diào)或通過敲低下調(diào)。相反，未被預(yù)測(cè)的miRNA靶向的EFNA4和FGF9不受影響。隨后新的體外轉(zhuǎn)錄結(jié)合體內(nèi)環(huán)化方案測(cè)試鞏固了circCCDC66作為miRNA海綿的作用。另外，實(shí)驗(yàn)表明在過表達(dá)circCCDC66時(shí)，MYC（circCCDC66上調(diào)蛋白）其3′-UTR區(qū)活性增強(qiáng)（miRNAs吸附減少）。敲減circCCDC66后發(fā)現(xiàn)MYC mRNA表達(dá)顯著減低。Rescue實(shí)驗(yàn)（加入miR-33b、miR-93抑制劑）后則能回復(fù)MYC mRNA水平。這些結(jié)果均表明circCCDC66能作為miRNA的海綿，調(diào)控MYC表達(dá)。

    我們將具有或不具有瞬時(shí)circCCDC66敲低的HCT116細(xì)胞皮下注射到NOD/SCID小鼠的背側(cè)，并使其增殖四周。用circCCDC66敲低的HCT116接種的腫瘤的生長被顯著抑制。此外，將具有或不具有瞬時(shí)circCCDC66敲低的HCT116細(xì)胞原位接種于NOD/SCID小鼠的盲腸中并使其增殖四周。對(duì)照組細(xì)胞形成的腫瘤積極地破壞平滑肌的襯里并插入肌細(xì)胞。相反，來自具有circCCDC66敲低的細(xì)胞的腫瘤通常沿平滑肌層的邊緣保留明顯的邊界。HCC116細(xì)胞在肝臟中形成結(jié)節(jié)的能力，可能是由于腫瘤從盲腸到肝臟的轉(zhuǎn)移，用circCCDC66敲低顯著降低。使用對(duì)泛角蛋白特異性的抗體的免疫組織化學(xué)染色顯示轉(zhuǎn)移的細(xì)胞確實(shí)是上皮細(xì)胞而不是肝細(xì)胞。

    總之，我們鑒定了一組在結(jié)直腸癌中表達(dá)的新型circRNA，其中，circCCDC66與治療結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。 CircCCDC66可用作海綿，保護(hù)多種癌基因免受miRNA的攻擊。我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)circRNA含有不同miRNA的不同結(jié)合位點(diǎn)，揭示了circRNA在癌癥惡性腫瘤中的復(fù)雜作用，并強(qiáng)調(diào)了研究復(fù)雜的circRNA-miRNA調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò)在癌癥進(jìn)展和治療效果中的重要性。這是第一份徹底研究circCCDC66在人類癌癥中的表達(dá)，調(diào)控，功能和臨床意義的報(bào)告。

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