UV Irradiation Induces a Non-coding RNA that Functionally Opposes the Protein Encoded by the Same Gene

紫外線照射誘導(dǎo)lncRNA功能性地抑制由相同基因編碼的蛋白質(zhì)

期刊：CELL；影響因子：31.398

發(fā)表單位：弗朗西斯克里克研究所

    紫外誘導(dǎo)外顯子可變剪接，引起ASCC3 基因形成長(zhǎng)和短兩種轉(zhuǎn)錄本，它們對(duì)DNA損傷后的轉(zhuǎn)錄恢復(fù)具有相反的作用，同時(shí)短同種型作為轉(zhuǎn)錄恢復(fù)所需的核非編碼RNA起作用。

    轉(zhuǎn)錄相關(guān)的DNA損傷反應(yīng)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行分析，具有很大的空間和時(shí)間分辨率。在UV照射后，觀察到轉(zhuǎn)錄物延伸的減慢和基因活性對(duì)近似約25kb的啟動(dòng)子的限制。這與從長(zhǎng)mRNA的表達(dá)向較短同種型的轉(zhuǎn)變相關(guān)，并且包含更接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的替代末端外顯子（ALE）。值得注意的是，這包括從編碼蛋白質(zhì)的ASCC3 mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)檩^短的ALE同種型，其中RNA而不是編碼的蛋白質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)錄的最終恢復(fù)至關(guān)重要。非編碼ASCC3同種型抵消蛋白質(zhì)編碼同種型的功能，表明它們之間的串?dāng)_。因此，ASCC3基因表達(dá)編碼和非編碼轉(zhuǎn)錄物同種型，其在UV誘導(dǎo)的DNA損傷后對(duì)轉(zhuǎn)錄恢復(fù)具有相反的作用。

    新生RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄物的有效生產(chǎn)和正確加工對(duì)生命至關(guān)重要。影響轉(zhuǎn)錄和mRNA剪接的因素，包括DNA損傷劑，因此可以對(duì)基因表達(dá)和細(xì)胞活力產(chǎn)生顯著影響。實(shí)際上，諸如由UV照射產(chǎn)生的那些龐大的DNA損傷引發(fā)RNA合成的快速關(guān)閉。它們還引發(fā)轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)修復(fù)，并且作為最后的手段，破壞平衡的RNA聚合酶II（RNAPII）的泛素化和降解。雖然轉(zhuǎn)錄起始和伸長(zhǎng)都受到紫外線照射的影響，但變化的程度，機(jī)制和功能后果在這些過(guò)程中發(fā)生的事情仍然知之甚少。

    我們采用了5,6-二氯-1-β-D-呋喃核糖基苯并咪唑/測(cè)序（DRB/GRO-seq），這允許以高時(shí)間和空間分辨率測(cè)量新生RNA合成。首先用轉(zhuǎn)錄延伸抑制劑DRB處理細(xì)胞以將RNA PII限制于啟動(dòng)子近端區(qū)域。然后進(jìn)行紫外線照射后，除去抑制劑以允許同步轉(zhuǎn)錄和通過(guò)GRO-seq進(jìn)行的全基因組測(cè)序。來(lái)自PPP1R12A基因的結(jié)果作為實(shí)例顯示。結(jié)果顯示在未處理的細(xì)胞中，RNA PII在DRB去除后10分鐘延伸基因約12kb，并且在25和40分鐘后分別延伸至約38kb和約74kb。在UV暴露后25和40分鐘觀察到RNAPII達(dá)到約15和約20kb。此外，8,148個(gè)轉(zhuǎn)錄本的Meta基因譜顯示，紫外線照射通常會(huì)明顯減弱延長(zhǎng)，未處理細(xì)胞40分鐘后新生RNA達(dá)到約75 kb，但紫外線照射后僅約25 kb。

    我們用細(xì)胞進(jìn)行GRO-seq實(shí)驗(yàn)，所述細(xì)胞再次以15J/m²進(jìn)行UV照射，然后回收。該劑量的UV在24小時(shí)的時(shí)間過(guò)程中沒(méi)有導(dǎo)致顯著的細(xì)胞死亡。有趣的是，紫外線照射后平均2至12小時(shí)的轉(zhuǎn)錄本延伸率僅為約40個(gè)堿基/分鐘，比未處理的細(xì)胞慢40倍以上。結(jié)果表明紫外線照射引起轉(zhuǎn)錄物延伸的速度顯著降低，甚至在紫外線照射幾小時(shí)后恢復(fù)新生RNA合成時(shí)，伸長(zhǎng)率仍然比未處理細(xì)胞慢得多。最重要的是，轉(zhuǎn)錄在空間上受到長(zhǎng)時(shí)間的限制，其中20-25kb的啟動(dòng)子顯示出比下游區(qū)域更多的活性。

    替代性末端外顯子（ALE）剪接是最常見(jiàn)的紫外線誘導(dǎo)事件。長(zhǎng)HERC4 前體mRNA同種型包含25個(gè)外顯子并且是153kb，而短HERC4前體mRNA是6.3kb，與長(zhǎng)同種型共享前三個(gè)外顯子，但包含第四個(gè)獨(dú)特的末端外顯子。UV照射后8小時(shí)，誘導(dǎo)外顯子1-4。相反，外顯子5-26（特異于長(zhǎng)同種型）的表達(dá)降低，但在24小時(shí)后恢復(fù)至接近正常水平。在INTS6基因和大量其他基因上觀察到類似的替代外顯子表達(dá)模式。qRT-PCR證實(shí)了在UV照射后8小時(shí)，短同種型的表達(dá)增加和長(zhǎng)同種型的伴隨的較低表達(dá)。UV誘導(dǎo)的ALE短事件的前體mRNA長(zhǎng)度的這種減少顯著大于偶然預(yù)期，表明在UV暴露時(shí)從特別長(zhǎng)的同種型轉(zhuǎn)換為更短的同種型的一般趨勢(shì)。相反，較不常見(jiàn)的UV誘導(dǎo)的長(zhǎng)ALE同種型的中值長(zhǎng)度約為30kb，僅比其相應(yīng)的UV抑制的短同種型的中值長(zhǎng)度長(zhǎng)9kb。

    在UV照射后，HERC4的GRO-seq讀數(shù)深度在編碼短同種型的區(qū)域上增加，而其余基因中的合成被顯著抑制。在UV暴露后24小時(shí)，整個(gè)基因的新生RNA合成恢復(fù)到未處理的水平，與HERC4 ALE剪接事件的動(dòng)力學(xué)相關(guān)。通過(guò)比較近端和遠(yuǎn)端末端外顯子的GRO-seq信號(hào)，觀察到短到長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物同種型表達(dá)比率的短暫增加，在UV后8-12小時(shí)達(dá)到峰值。這種增加與遠(yuǎn)端合成的減少相關(guān)，而不是近端外顯子，并且對(duì)于UV誘導(dǎo)的ALE事件是特異性的。總之，迄今為止所呈現(xiàn)的結(jié)果表明UV照射導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的顯著變化，延伸減慢并且RNAPII介導(dǎo)的RNA合成被“限制”到基因的5'末端。轉(zhuǎn)錄的這種基因-空間限制與包含備選的最后外顯子的短轉(zhuǎn)錄物同種型的優(yōu)先表達(dá)相關(guān)或?qū)嶋H上引起。

    經(jīng)歷UV誘導(dǎo)的ALE短同種型轉(zhuǎn)換的84個(gè)基因的基因本體分析顯示它們中的許多參與轉(zhuǎn)錄。我們還用最近匯編的在轉(zhuǎn)錄相關(guān)的DNA損傷反應(yīng)中起作用的因子數(shù)據(jù)庫(kù)交叉引用了這些基因。有趣的是，ASCC3脫穎而出，它在多組分篩選方法中得分最高。產(chǎn)生長(zhǎng)ASCC3同種型的前mRNA是373.5kb。短ASCC3同種型長(zhǎng)度為25kb，與前同種型共有前三個(gè)外顯子，然后是獨(dú)特的末端外顯子。UV處理后8小時(shí)，兩種同種型的外顯子表達(dá)均降低。然而，在UV處理后24小時(shí)，短同種型的外顯子的表達(dá)增加，而長(zhǎng)同種型的特異性表達(dá)仍然受到抑制。ASCC3的轉(zhuǎn)錄特征與ALE轉(zhuǎn)換相關(guān)，并且在UV照射后優(yōu)先產(chǎn)生短ASCC3同種型。

    ASCC3是研究較少的激活信號(hào)復(fù)合物的組分。靶向ASCC復(fù)合體ASCC1和ASCC2的另外兩個(gè)成員的siRNA也導(dǎo)致紫外線照射后新生轉(zhuǎn)錄增加，表明在DNA損傷后ASCC復(fù)合物作為保持轉(zhuǎn)錄被抑制的實(shí)體起作用。此外，兩個(gè)單獨(dú)的ASCC3 siRNA，以及靶向長(zhǎng)同種型的穩(wěn)定shRNA表達(dá)在DNA損傷后20小時(shí)增加轉(zhuǎn)錄，但不影響未處理細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄，或在UV照射后2小時(shí)觀察到立即轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。在2小時(shí)和20小時(shí)的差異效應(yīng)是重要的，因?yàn)樗砻鬓D(zhuǎn)錄在UV誘導(dǎo)的DNA損傷期間以兩種不同的方式被抑制，即快速ASCC3非依賴性轉(zhuǎn)錄抑制，然后在DNA損傷反應(yīng)后期繼續(xù)ASCC3依賴性抑制。響應(yīng)于UV暴露，ASCC3的長(zhǎng)同種型的敲低顯著降低了這種低/高轉(zhuǎn)錄比。我們得出結(jié)論，在ASCC復(fù)合物的背景下，ASCC3蛋白在細(xì)胞對(duì)紫外線照射的反應(yīng)的晚期特異性地抑制轉(zhuǎn)錄。

    與siRNA pool-1形成鮮明對(duì)比的是，ASCC3 siRNA pool-2在UV照射后顯著降低了轉(zhuǎn)錄。pool-2中的四種siRNA中的兩種特異性靶向短替代轉(zhuǎn)錄物同種型的末端外顯子獨(dú)特的序列，分別將短同種型轉(zhuǎn)錄物水平降低79％和82％。用這些siRNA敲低既不影響未處理細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，也不影響紫外線照射后的全球轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。然而，以類似于Cockayne綜合征B的敲低的方式，敲低ASCC3短同種型抑制轉(zhuǎn)錄恢復(fù)，如通過(guò)細(xì)胞群體的新生轉(zhuǎn)錄特征的顯著的一般變化所示。因此，在UV照射后，低轉(zhuǎn)錄細(xì)胞與高轉(zhuǎn)錄細(xì)胞的比例增加。此外，ASCC3的敲低導(dǎo)致對(duì)UV照射的敏感性增加。這表明UV誘導(dǎo)的短ASCC3 ALE同種型的表達(dá)確實(shí)在生理上是重要的，因?yàn)檫@種同種型是轉(zhuǎn)錄在UV照射后恢復(fù)所必需的。

    我們現(xiàn)在使用Illumina BeadArrays來(lái)比較它們?cè)?/span>UV照射后20小時(shí)對(duì)穩(wěn)定mRNA表達(dá)的影響。與UV處理的對(duì)照細(xì)胞相比，在該時(shí)間點(diǎn)，108個(gè)基因在短的敲除細(xì)胞中差異表達(dá)，其中大部分（73％）下調(diào)。相反，170個(gè)基因在缺乏ASCC3長(zhǎng)同種型（長(zhǎng)敲低細(xì)胞）的細(xì)胞中差異表達(dá)，其中64％上調(diào)。有趣的是，許多在短敲除細(xì)胞中下調(diào)的基因在長(zhǎng)敲低細(xì)胞中上調(diào)。我們還注意到，在對(duì)照細(xì)胞中紫外線照射后20小時(shí)，受ASCC3影響最大的一部分基因?qū)嶋H上被大大誘導(dǎo)。實(shí)際上，在短的敲除細(xì)胞中很大程度上消除了五種這樣的基因的表達(dá)增加。引人注目的是，所有這些基因在長(zhǎng)敲低細(xì)胞中都被“過(guò)度誘導(dǎo)”，再次指出長(zhǎng)和短ASCC3 RNA同種型的相反調(diào)節(jié)作用。

    UV誘導(dǎo)的短mRNA同種型含有333nt編碼序列（CDS），其蛋白質(zhì)產(chǎn)物僅為13kDa并且缺乏已知的功能結(jié)構(gòu)域。除333nt CDS外，內(nèi)源性ASCC3短同種型轉(zhuǎn)錄物還含有2.8kb 3'非翻譯區(qū)（3'-UTR），這是該同種型所特有的。我們表達(dá)ASCC3短同種型，包括3'序列，其本身不含有很長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框（ORF）。重要的是，13kDa編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)至相似的水平，而不考慮轉(zhuǎn)錄物中3'-UTR的含量。然而，值得注意的是，與單獨(dú)的CDS相反，含有3'-UTR的轉(zhuǎn)錄物抑制了低轉(zhuǎn)錄表型。這些結(jié)果表明短ASCC3同種型通過(guò)RNA介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)轉(zhuǎn)錄重啟，而不是蛋白質(zhì)。我們使用表達(dá)CDS及其3'UTR的構(gòu)建體，但這次在CDS開(kāi)始時(shí)插入過(guò)早停止突變。正如所料，該構(gòu)建體未能產(chǎn)生蛋白質(zhì)。然而，它拯救了缺乏短同種型的細(xì)胞中的低轉(zhuǎn)錄表型，表明短ASCC3同種型必須起非編碼RNA的作用。

    在本報(bào)告中，我們提供了紫外線照射對(duì)轉(zhuǎn)錄物延伸的顯著和全局影響的證據(jù)，其影響RNA加工并提供細(xì)胞調(diào)節(jié)的顯著潛力。UV暴露導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的空間限制和較慢的延伸，結(jié)果僅有20-25kb的啟動(dòng)子被有效轉(zhuǎn)錄。這些事件共同構(gòu)成了短mRNA同種型表達(dá)的轉(zhuǎn)變以及許多基因（包括ASCC3）中替代性最后外顯子的優(yōu)先使用的基礎(chǔ)。有趣的是，短和長(zhǎng)同種型構(gòu)成自主調(diào)節(jié)模塊并且在功能上相互關(guān)聯(lián)，因此通過(guò)刪除另一個(gè)可以至少部分地補(bǔ)償刪除一個(gè)的效果。

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